German Title: Toxikogenomische Ansätze zur Prädiktion von Hepatotoxizität in vitro

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Abstract

Die pharmazeutische und chemische Industrie ist daran interessiert, in vivo Experimente so weit wie möglich durch alternative in vitro Methoden mit Möglichkeiten zu ersetzen, die das Sicherheitsprofil ihrer Produkte besser erfassen. Dies wird beeinflusst durch die 3R-Prinzipien, das Reduzieren der Anzahl von Tierversuchen, die Verbesserung existierender Experimente und dem Ersetzen von Tierversuchen durch alternative Methoden Russell & Burch, 1959). Letzteres wird ebenfalls durch EU geförderte Programme unterstützt und ist das Ziel verschiedener regulatorischer Richtlinien. Ein zentrales Ziel der Sicherheitstestung neuer chemikalischer Produkte ist die Leber. Dies ist nicht überraschend, da die Leber das Hauptorgan des Fremdstoffmetabolismus ist. Momentan werden viele verschiedene Primärhepatozyten-Kultursysteme für die Untersuchung von akuter Toxizität, den zugrunde liegenden Mechanismen, dem Metabolismus oder der Enzym-Induktion eingesetzt. Zurzeit gibt es jedoch keine etablierte und standardisierte Kulturmethode, welche die hepatozytenspezifischen Funktionen erhält und somit Langzeitversuche ermöglichen würde. Die vorliegende Doktorarbeit hatte das Ziel solch eine Methode in Form der Sandwich-Kultur zu entwickeln und dadurch den Differenzierungsgrad der Zellen sowie deren metabolische Aktivität zu erhalten. Um Vor- und Nachteile dieser Kulturmethode zu beleuchten wurde sie mit anderen, momentan verwendeten, Methoden verglichen. Die globale Genexpressionsanalyse zeigte gemeinsame, durch die Leber-Perfusion verursachte, Effekte sowie individuelle Unterschiede der verschiedenen Zellkulturen. Basierend auf diesem Wissen wurden toxikologisch relevante Studien mit dem Sandwich-Kultur-System durchgeführt. Dafür wurden die Zellen mit fünfzehn Modellsubstanzen behandelt, anhand ihrer globalen Genexpressionsprofile ein diskriminatives Prädikitonsmodel für Hepatotoxizität erstellt und ein Set von 724 prädiktiven Genen definiert. Dieses Model wurde danach erfolgreich mit einer verblindeten Substanz und mit Acetaminophen getestet. Die Nutzung einer neuen Plattform zur globalen Genexpressionsanalyse von Illumina ermöglichte den detaillierten Vergleich mit der zurzeit meistverwendeten Plattform (Affymetrix) sowie mit der TaqMan PCR. Hierbei wurden verschiedenste technische Parameter auf Übereinstimmung und Sensitivität überprüft und die biologische Interpretation von mit beiden Plattformen gemessenen in vivo und in vitro Studien verglichen. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten die hohe Übereinstimmung zwischen beiden Mess-Plattformen, die eine Anwendung beider in toxikogenomischen Studien erlaubt. Zusammenfassend lässt sich sagen dass toxikogenomische Studien in Verbindung mit einem in vitro Test System verlässliche und viel versprechende Ergebnisse liefert und neue Einblicke in den Wirkmechanismus von Substanzen ermöglicht. Zusätzlich ermöglicht die Klassifizierung von Substanzen mit Hilfe des erstellten Prädiktionsmodells ein frühes Screening in der Medikamentenentwicklung.

Translation of abstract (English)

The pharmaceutical and chemical industry is interested to replace as much as possible in vivo experiments with alternative in vitro models which have improved capability to assess and predict the safety profile of their products. This is influenced by the 3R principles of reducing the number of tests, the refinement of existing experiments and the replacement of animal experiments with new and alternative methods (Russell & Burch, 1959). The latter is also supported by EU-programms, which ultimately will be reflected in new regulatory guidelines. One major target in the safety testing of new chemical products is the liver. This is not surprising as the liver is the major organ for xenobiotic metabolism. Several different culture systems for primary hepatocytes are actually in use for the study of acute toxicity, the basic mechanisms of action, metabolism or enzyme induction. Yet, there is no established and standardized culture method maintaining hepatocyte specific functionality for longer term experiments. This PhD work has the aim of developing a longer-term sandwich culture model which maintains hepatocytes in their differentiated and metabolically active state. To elucidate advantages and disadvantages of this culture, it was compared to several currently used culture models. Functional tests revealed an improved metabolic activity and viability over time in culture. Global gene expression analysis showed common effects caused by the liver perfusion as well as individual differences in the different culture systems. The improved sandwich culture was applied to a toxicologically relevant study in which the cells were dosed with fifteen well known model compounds (hepatotoxins and negative controls) and the global gene expression data was used to build a predictive discrimination model for hepatotoxicity based on a defined gene set of 724 genes. This model was successfully applied on a blinded compound and on acetaminophen, which both were correctly classified to be hepatotoxic. The use of the new Illumina global gene expression platform enabled a detailed comparison with the current state of the art technologies from Affymetrix and TaqMan real time PCR. Several technical parameters were checked for concordance and sensitivity between both platforms and the biological interpretation of an in vivo and in vitro toxicogenomics study was compared. The results of these studies revealed a high concordance between both platforms making both of them equally applicable for toxicogenomics studies. In conclusion, the field of toxicogenomics, applied to an in vitro test system proved to deliver reliable and promising results allowing new insights into the mechanism of compound toxicity. Additionally, the prediction of toxicity of new compounds, with the help of a classification model, based on a large dataset of model compounds, seems to be applicable for early screening in drug development.