English Title: Effects and mechanisms after inhibition of the 26S proteasome in human dendritic cells and T cells

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Abstract

Das Proteasom stellt die zentrale proteolytische Maschinerie des hoch konservierten Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) dar. Dieses System ist für die Regulation und Aufrechterhaltung von wesentlichen zellulären Prozessen, wie z.B. Differenzierung, Proliferation, Zellzyklus, Gentranskription und Apoptose erforderlich. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwiefern die spezifischen Proteasom-Inhibitoren Bortezomib, Lactacystin und Epoxomycin essentielle Immunfunktionen von aus Monozyten-generierten humanen DCs und von durch allogene DCs aktivierte humane CD4+ T-Zellen supprimieren. Darüber hinaus sollten die Mechanismen der Apoptose-Induktion in aktivierten CD4+ T-Zellen durch den Proteasom-Inhibitor Bortezomib aufgeklärt werden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der proteolytischen Aktivität des 26S Proteasom in humanen unreifen DC (iDC) und reifen DC (mDC) die Expression wichtiger Zelloberflächenrezeptoren von DCs supprimiert, Apoptose induziert und die Maturation von DCs inhibiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Proteasom-Inhibition die Makropinozytose und Rezeptor-vermittelte Endozytose von Antigenen einschränkt und die Synthese von Interleukin (IL)-12p70 und IL-12p40 hemmt. Als funktionelle Konsequenz, zeigten mDCs, welche eine Proteasom-Inhibition überlebten, eine deutlich supprimierte Kapazität allogene CD4+ und CD8+ T-Zellen und autologe CD4+T-Zellen zu stimulieren. Ferner konnte diese Arbeit demonstrieren, dass eine Proteasom-Inhibition in aktivierten CD4+ T-Zellen Apoptose induziert. Aktivierte CD4+ T-Zellen, die die Proteasom-Inhibition überlebten, zeigten eine Inhibition der Proliferation durch die Induktion eines Zellzyklus-Arrests in der G1-Phase. Dieses ging einher mit der Akkumulation von Proteinen, welche bekanntermaßen die Transition des Zellzyklus von der G1- in die S-Phase steuern. Des Weiteren konnte demonstriert werden, dass aktivierte CD4+ T-Zellen nach Proteasom-Inhibition eine verringerte Expression von mit einer Aktivierung assoziierten Zelloberflächenrezeptoren sowie eine verringerte Produktion von inflammatorischen Zytokinen aufweisen. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass eine Proteasom-Inhibition die Aktivierung und nukleäre Translokation von NFATc2 und die proteasomale Degradation des Inhibitor of kappaB-alpha- (IkappaBalpha-) Protein in aktivierten CD4+ T-Zellen inhibiert. Die Proteasom-Inhibition aktivierte den mitochondrialen Apoptoseweg in aktivierten CD4+ T-Zellen. Dieses erfolgte über eine Störung des Gleichgewichts zwischen pro- und anti-apoptotischen Proteinen an der äußeren mitochondrialen Membran. Die rasche Freisetzung der intramitochondrialen pro-apoptotischen Proteine Smac/DIABLO und HtrA2 antagonisierte die IAP-vermittelte Inhibition der moderat proteolytisch-aktiven Caspasen und eine rasche Zunahme der Caspase-3-Aktivität vor einer Caspase-9-Aktivitäts-Steigerung konnte demonstriert werden. Daraus kann geschlossen werden, dass Caspase-3 im Verlauf einer Proteasom-Inhibition in aktivierten CD4+ T-Zellen den intrinsischen Apoptoseweg initiiert. Caspase-9 fungiert dagegen nur als Apoptose-Verstärker. Insgesamt demonstriert die vorliegende Arbeit, dass die proteasomale Aktivität für essentielle Funktionen von humanen DCs und aktivierten humanen CD4+ T-Zellen benötigt wird und ein molekulares Ziel für eine Suppression von dysregulierten und unerwünschten Immunantworten definiert werden kann.

Translation of abstract (English)

The proteasome constitutes the central proteolytic machinery of the highly conserved ubiquitin-proteasome-system (UPS), required for the maintenance and regulation of basic cellular processes, including differentiation, proliferation, cell cycling, gene transcription and apoptosis. The present thesis aimed to investigate the ability of the specific proteasome inhibitors bortezomib, lactacystin and epoxomycin to suppress essential immune functions of human monocyte-derived DCs and activated CD4+ T cells. In addition, the mechanisms of apoptosis induction of activated CD4+ T cells by the proteasome inhibitor bortezomib were elucidated. Inhibition of proteolytic activity of 26S proteasome in human immature DC (iDC) and mature DC (mDC) suppresses the expression of important cell surface receptors of human iDC and mDC. Moreover, proteasome inhibition induces apoptosis and impairs maturation of DCs. Inhibition of proteasome inhibits macropinocytosis and receptor-mediated endocytosis of antigens in iDC, and suppresses the synthesis of interleukin (IL)-12p70 and IL-12p40. As a functional consequence, the capacity of mDCs surviving proteasome inhibition is dramatically suppressed regarding stimulation of allogeneic CD4+ and CD8+ T cells and autologous CD4+ T cells. Moreover the present thesis demonstrates that proteasome inhibition induces apoptosis in activated CD4+ T cells. Activated CD4+ T cells surviving proteasome inhibition undergo inhibition of proliferation as a result of induction of G1 phase cell cycle arrest, which is accompanied by the accumulation of proteins known to regulate G1 to S phase cell-cycle transitions. In addition, expression of the activation-associated cell surface receptors as well as production of inflammatory cytokines are suppressed in response to proteasome inhibition in CD4+ T cells activated by DCs. The present thesis demonstrates that proteasome inhibition suppresses activation and nuclear translocation of NFATc2 and causes accumulation of Inhibitor of kappaB-alpha (IkappaB-alpha-) in activated CD4+ T cells. Proteasome inhibition activates the mitochondrial pathway of apoptosis in activated CD4+ T cells by disrupting the equilibrium of pro- and antiapoptotic proteins at the outer mitochondrial membrane. Activated Bax-like proteins induces rapid release of intramitochondrially proapoptotic Smac/DIABLO and HtrA2, which eliminate IAP-mediated inhibition of partially activated caspases. The present thesis demonstrates an increase of caspase-3 activity before caspase-9-activity is enhanced. Thus, this study suggests, that caspase-3 in CD4+ T cells in response to proteasome inhibition initiates the intrinsic apoptosis pathway. In contrast, caspase-9 functions only as accelerator of apoptosis. In summary, this thesis shows that the proteasomal activity is required for essential functions of human DCs and activated human CD4+ T cells and can be defined as a molecular target for the suppression of deregulated and unwanted immune responses.