German Title: Funktionale Charakterisierung des LCMV GP-C Signalpeptids

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Abstract

N-terminal signal sequences of secretory and membrane proteins mediate targeting to and translocation across the endoplasmic reticulum (ER) membrane. After membrane insertion, signal sequences are in most cases cleaved from the precursor protein by signal peptidase (SPase). Signal sequences are usually 15 to 25 amino acid residues in length and have a typical tripartite structure with a central hydrophobic core of about 7 to 10 residues, a polar N-terminal region, and a short C-terminal region which contains the SPase cleavage site. Insertion of the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) precursor glycoprotein C (pGP-C) into the membrane of the ER is mediated by an unusual signal sequence. It comprises 58 amino acid residues and contains an extended N-terminal region including a myristoylation consensus site and two hydrophobic regions separated by a lysine residue. After cleavage by SPase, the resulting signal peptide (SPGP-C) accumulates in cells and virus particles. The aim of this study was to characterize the post-targeting functions of the LCMV SPGP-C. It could be shown that the LCMV SPGP-C is an essential component of the glycoprotein complex and that different regions of SPGP-C are required for distinct steps in glycoprotein maturation and virus infectivity. The investigation of SPGP-C deletion mutants showed that one hydrophobic region of LCMV SPGP-C is sufficient for ER membrane insertion of GP-C, while both hydrophobic regions are required for GP-C processing into its subunits and cell surface expression of the glycoprotein complex. The N-terminal region of SPGP-C and its myristoylation are dispensable for these steps in GP-C maturation, however, were found to be essential for viral infection of target cells. The analysis of a possible association of LCMV SPGP-C with GP-C by co-immunoprecipitation revealed that the LCMV SPGP-C is part of the glycoprotein complex and interacts with the membrane-anchored GP-2 subunit. For this non-covalent interaction the hydrophobic regions of SPGP-C are sufficient and essential, whereas the N-terminal region is not required. As the LCMV SPGP-C possesses two hydrophobic regions, different topologies across the membrane are conceivable. The membrane topology of SPGP-C was investigated using point mutations introducing potential N-glycosylation sites throughout the SPGP-C. It could be shown that unmyristoylated SPGP-C exposes its N-terminal region to the exoplasmic side of the membrane. This SPGP-C can promote GP-C maturation but is defective in viral infection. Myristoylation and SPGP-C membrane topology may thus hold the key to unravel the role of LCMV SPGP-C in GP-C complex assembly and function.

Translation of abstract (German)

N-terminale Signalsequenzen von sekretorischen Proteinen und von Membranproteinen vermitteln den zielgerichteten Transport zum endoplasmatischen Retikulum (ER) und die Translokation der Proteine durch die ER-Membran. In den meisten Fällen wird die Signalsequenz nach der Membraninsertion durch die Signalpeptidase (SPase) vom Präprotein abgespalten. Signalsequenzen besitzen üblicherweise eine Gesamtlänge von 15 bis 25 Aminosäuren und sind in drei Regionen unterteilt: einen zentralen hydrophoben Kern bestehend aus 7 bis 10 Aminosäuren, einer polaren N-terminalen Region und einer kurzen C-terminalen Region, die die SPase Spaltstelle beinhaltet. Die Insertion des lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) Glykoproteins (pGP-C) in die Membran des ER wird durch eine ungewöhnliche Signalsequenz vermittelt. Diese Signalsequenz besteht aus 58 Aminosäuren und besitzt eine erweiterte N-terminale Region einschließlich einer Konsensussequenz für Myristoylierung und zwei hydrophobe Regionen, die durch ein Lysin getrennt sind. Nach der Abspaltung durch die SPase akkumuliert das resultierende Signalpeptid (SPGP-C) in Zellen und in Viruspartikeln. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der Funktionen des LCMV SPGP-C über den zielgerichteten Transport hinaus. Es konnte gezeigt werden, dass das LCMV SPGP-C ein essentieller Bestandteil des Glykoproteinkomplexes ist und dass die unterschiedlichen Regionen des SPGP-C für verschiedene Schritte während der GP-C-Reifung und für die Infektiosität des Virus benötigt werden. Die Untersuchung von SPGP-C Deletionsmutanten zeigte, dass eine hydrophobe Region des LCMV SPGP-C für die Insertion von GP-C in die ER-Membran genügt, wohingegen beide hydrophobe Regionen für die Prozessierung von GP-C in seine Untereinheiten und für den Transport des Glykoproteinkomplexes zur Zelloberfläche benötigt werden. Die N-terminale Region des SPGP-C und dessen Myristoylierung werden für diese Schritte der GP-C-Reifung nicht benötigt, sind jedoch essentiell für die virale Infektion von Zielzellen. Die Analyse einer möglichen Assoziierung des SPGP-C mit GP-C durch Koimmunopräzipitation zeigte, dass das LCMV SPGP-C ein Bestandteil des Glykoproteinkomplexes ist und dass es mit der membranverankerten GP-2 Untereinheit interagiert. Die hydrophoben Regionen des SPGP-C sind für diese nichtkovalente Interaktion ausreichend und essentiell, wohingegen die N-terminale Region nicht benötigt wird. Aufgrund der zwei hydrophoben Regionen des LCMV SPGP-C sind verschiedene Topologien in der Membran vorstellbar. Zur Untersuchung wurden potenzielle N-Glykosylierungsstellen durch Punktmutationen in SPGP-C eingefügt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die N-terminale Region des nicht-myristoylierten SPGP-C auf der exoplasmatischen Seite der Membran befindet. Dieses SPGP-C ist fähig die GP-C-Reifung zu begünstigen, verhindert jedoch die virale Infektion. Die Myristoylierung und die Topologie des SPGP-C könnten daher den Schlüssel zur Funktion des SPGP-C innerhalb des Glykoproteinkomplexes darstellen.