English Title: Identification and characterization of interactions of the small GTPase Arf1 during COPI vesicle biogenesis

Preview

PDF, German Download (13MB) | Terms of use

Abstract

Die kleine GTPase Arf1 übernimmt eine zentrale Rolle während der COPI Vesikel- Biogenese. Im inaktiven, Arf1-GDP Zustand liegt Arf1 überwiegend als lösliches Protein im Cytosol vor. Durch Interaktionen mit Proteinen der p24 Familie wird Arf1-GDP an die Golgi-Membranen rekrutiert. Es folgt der Austausch von GDP zu GTP wodurch Arf1 eine Konformationsänderung erfährt und die Interaktion zwischen Arf1 und den p24 Proteinen aufgehoben wird. Anschließend rekrutiert Arf1-GTP zusammen mit den p24 Proteinen den Coatomer-Komplex aus dem Cytosol an die Golgi-Membran. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion der p24 Proteine als Arf1-GDP Rezeptoren näher untersucht. Mit Hilfe der SPR-Technologie (BIAcore) wurde die direkte Interaktion zwischen Arf1-GDP und allen bis heute in Säugerzellen nachgewiesenen p24 Proteinen überprüft. Hierzu wurden Peptide, die der cytoplasmatischen Domäne der p24 Proteine entsprechen, in monomerer und homo oder heterodimerer Form eingesetzt. Es konnte nachgewiesen werden, dass p24 Proteine in monomerer Form nicht an Arf1-GDP binden. Im Gegensatz dazu interagieren die Homodimere p23 und p24 sowie die Heterodimere p23/p24, p23/27 und etwas schwächer p24/p27 mit Arf1-GDP. Die SPR-Ergebnisse konnten anschließend biochemisch durch Bindungsstudien an isolierten Golgi-Membranen bestätigt werden. Desweiteren wurden alle Heterodimere auf ihre Fähigkeit zur Coatomer-Aggregation getestet. Dabei konnte gezeigt werden, dass alle p24 Proteine, die mit Arf1-GDP interagieren, auch zur Polymerisierung von Coatomer beitragen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden photolabile, myristoylierte Arf1-Derivate in vivo generiert, auf ihre Funktionalität überprüft und anschließend in Bindungsstudien eingesetzt. Hierdurch konnte zum einen die Interaktion von Arf1-GTP mit β- und γ-COP bestätigt werden. Auf Grund der höheren Mengen an erzielten Crosslinkprodukten war es möglich, diese Interaktionen näher zu analysieren. So konnte gezeigt werden, dass Arf1-GTP an beide Isoformen der γ-Untereinheit (γ1- und γ2-COP) bindet und die switch1 Region von Arf1 mit den Trunk-Domänen von β- und γ-COP wechselwirkt. Zum anderen wurde eine neue Interaktion von Arf1 mit der Coatomer-Untereinheit δ-COP gefunden. Untersuchung der Abfolge der Wechselwirkungen von Arf1 mit Coatomer führen zu einem Modell bei dem es sich bei der Rekrutierung von Coatomer durch Arf1-GTP um einen mehrstufigen Prozess handelt. Außerdem deuten die Bindungsstudien mit photolabilen Arf1-Derivaten auf eine gleichzeitige Bindung mehrerer Arf1 Moleküle an Coatomer hin und somit auf die Existenz einer oligomeren Arf1 Form.

Translation of abstract (English)

The small GTPase Arf1 plays a key role in the formation of COPI coated vesicles. Upon recruitment to the donor membrane by interaction with dimeric p24 proteins, Arf1’s GDP is exchanged for GTP. Arf1-GTP then dissociates from p24, and together with members of this family of transmembrane proteins, it recruits the cytosolic coatomer complex to the Golgi membrane. In this work the function of the p24 proteins as Arf1-GDP receptors was analyzed. To this end, the SPR technology (BIAcore) was used to measure the interactions between Arf1-GDP and peptides in different oligomeric forms, corresponding to the cytoplasmic tails of the p24 proteins. In their monomeric forms, none of the peptides bound to Arf1-GDP. In contrast, the homodimeric forms of p23 and p24 as well as the heterodimeric forms p23/p24, p23/p27 and p24/p27 showed an interaction with Arf1-GDP. These SPR results were confirmed by competition experiments using isolated Golgi membranes and full-lenght Arf1. Furthermore, the heterodimeric forms of the p24 proteins were probed for their ability to aggregate coatomer, and only those proteins that bound to Arf1-GDP were able to induce coatomer polymerisation. In a second part full-length, myristoylated, photolabile Arf1 derivatives were generated employing a new in vivo expression method. Having shown the functionality of these derivatives, the photolabile proteins were used for binding studies. It was confirmed that Arf1 through its switch 1 region specifically interacts with the β- and γ-COP subunits of coatomer. Because of the higher amounts of crosslink-products available, these interactions could be further characterized. Interaction of Arf1-GTP with the trunk domains of β- and γ-COP was mapped. In addition it was shown that Arf1 binds to both isoforms of γ-COP (γ1 and γ2). Additional investigations on the binding of Arf1 to coatomer identified δ-COP as another binding partner. Further analysis of the Arf1-coatomer interactions lead to the assumption that the recruitment of coatomer to the Golgi membrane is a stepwise process. Finally, binding studies with photolabile Arf1 proteins revealed that more than one Arf1 molecule can interact with coatomer simultanously, and this indicates that Arf1 does not only exist as a monomer but can also form dimers or even higher oligomers.