English Title: Isolation and characterization of organizing factors of the vimentin filament system

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Abstract

In dieser Arbeit wurden Organisationsfaktoren des Vimentin-Filamentsystems mit Hilfe eines „Y2H“-Systems isoliert und charakterisiert. Als „Fänger“-Protein sollte die alpha-helikale zentrale Rod-Domäne von Vimentin, die den größten Teil des Moleküls darstellt und die im wesentlichen die Filamentoberfläche bildet, verwendet werden. Wir konnten in vitro und in vivo die Interaktion mit einer Reihe von unterschiedlichen Proteinfaktoren, umgeschrieben aus einer HeLa cDNA-Bibliothek, mit dem IF-Protein Vimentin zeigen. Diese Proteinfaktoren waren bisher nicht als Interaktionspartner von Vimentin bekannt. Es handelt sich dabei nicht nur um cytoplasmatische sondern auch um kernständige Proteine. Die Beobachtung, dass auch kernständige Proteine mit Vimentin interagieren, lässt sich aus der Tatsache erklären, dass Vimentin-filamente als Matrix für cytoplasmatische und während der Mitose auch für nukleäre Proteine dienen können und somit eine geordnete Aufteilung dieser Proteine auf die entstehenden Tochterzellen ermöglichen könnten. Nach sorgfältiger Analyse der isolierten Interaktionspartner wurde die Wechselwirkung und die biologische Funktion eines Interaktionspartners näher untersucht. Die Wahl fiel hierbei auf ein Chaperon aus der Hsp40-Proteinfamilie. Durch „GST-pull-down“-Experimente mit der Vimentin-Rod-Domäne und Präzipitationsversuchen mit assemblierten Vimentinfilamenten konnte das Hsp40-Protein aus einem HeLa-Zell-Lysat isoliert werden und somit eine biochemische Interaktion zwischen beiden Proteinen nachgewiesen werden. Diese Interaktion wurde auch durch Ko-Immunlokalisation des GFP-markierten Hsp40-Proteins mit Vimentin in verschiedenen Gewebekulturzellen bestätigt. Die Ko-Lokalisation wurde weiterhin durch Immun-Elektronenmikroskopie abgesichert. Selbst nach differentieller Extraktion der Zellen mit 3 M NaCl verblieb noch ein beträchtlicher Teil der Hsp40-Proteine an den salzstabilen Vimentinfilamenten gebunden. Nach Colcemid-induzierter Umlagerung der Vimentinfilamente um den Zellkern der vergifteten Zellen, war auch in einigen Zellen eine Umverteilung der Hsp40-Proteine zu beobachten. Erstaunlicherweise wurde durch eine verminderte Hsp40-Synthese, verursacht durch ein RNAi-„kock-down“-Experiment, der Vimentin-Gehalt der betroffenen Zellen sowie die Ausdehnung des Netzwerks stark beeinflusst. Diese Ergebnisse sprechen für eine physiologische Wechselwirkung von Vimentin mit den Hsp40-Proteinen. Eine organisatorische Funktion der Hsp40-Proteine beim Filamentzusammenbau oder dem Erhalt eines intakten Netzwerks ist durch diese Arbeit wahrscheinlich gemacht worden. Somit sollten bei der zukünftigen Erforschung der Cytoskelett-Organisation die Proteine der Hsp40-Familie ins Zentrum gerückt werden.

Translation of abstract (English)

In order to characterize and isolate organizing factors of the vimentin filament system we performed a Y2H-screen with the a-helical rod-domain of vimentin as bait. This domain represents the major part of the filament surface. Within this study we were able to isolate several different interaction candidates from a HeLa-cDNA-library. None of these has been described as vimentin-binding partner before. They represent cytoplasmic as well as nuclear proteins. The potential functions of vimentin IFs during mitosis are completely elusive, but we assume that it interacts extensively with nuclear proteins after breakdown of the nuclear envelope. Therefore, we extended our attention also to the isolated nuclear factors. After analysing the interaction of the vimentin rod-domain with several of the isolated binding partners in vitro and in vivo, we examined the binding properties and the biological function of one specific protein, namely a chaperone of the Hsp40-protein family. In GST-pull-down experiments employing a GST-vimentin rod-domain chimera and in precipitation experiments using in vitro assembled vimentin filaments with a HeLa-cell extract, we demonstrated a biochemical interaction between vimentin and the Hsp40-protein. The interaction with immunolocalized vimentin filaments was also detected with GFP-tagged Hsp40-protein or by double immunofluorescence microscopy using specific antibodies against both proteins. Immunoelectron microscopic studies enabled us to substantiate this interaction at the ultrastructural level. Even after extraction of HeLa-cells with NaCl (0,2 - 3 M), we observed Hsp40-proteins bound to salt-stable vimentin filaments through all stages of extraction. After treatment of HeLa-cells with colcemid, the concomitant reorganization of vimentin and Hsp40 was observed in some cells. Interestingly, down-regulation of the Hsp40-protein by RNA-interference led to a reduced vimentin expression and an altered spreading of the filament network in affected cells. Together these experiments underscore a physiological interaction of vimentin with Hsp40 and reveal the possibility that Hsp40 functions as a chaperone both during the filament assembly process and the maintenance of the existing filament networks. In summary, our experiments identified and demonstrated the engagement of heat shock proteins in the organization of the vimentin intermediate filament system.