English Title: Characterization of HIV-Nef in an infectable small animal model

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Abstract

Das virale Nef-Protein ist eine wichtige Determinante für die Infektiosität und die Pathogenese des humanen und simianen Immundefizienzvirus. Die Bedeutung des Nef-Proteins wird durch Studien an nef-transgenen Mäusen, die eine AIDS-ähnliche Krankheit entwickeln, demonstriert. Um Funktionen von Nef in einem infizierbaren Kleintiermodell zu untersuchen wurden neonatale Mäuse mit replikationskompetentem Moloney Maus Leukämie Virus (MoMuLV) infiziert, das für HIV-nef (Mo-NL) oder eine entsprechende Kontrolle (Mo-GFP, Mo) kodierte. Das Einfügen eines Fremdgens beeinträchtigte die Bildung infektiöser Viren nicht. Die Titer rekombinanter MoMuLV und des Wildtyp-Virus Mo waren in vitro vergleichbar. Untersuchungen an primären T-Lymphozyten haben gezeigt, dass Nef die zelluläre Kinase Pak aktiviert und CD4 von der Zelloberfläche heruntereguliert. Somit waren die Voraussetzungen für die Untersuchungen im Mausmodell gegeben. Die Zahl der GFP-exprimierenden T-Zellen Mo-GFP-infizierter Mäuse wurde in der FACS-Analyse bestimmt. Die Expression von GFP war über mindestens 13 Wochen detektierbar, wobei die Zahl GFP-positiver CD4+ T-Zellen im peripheren Blut auf bis zu 60% anstieg. Ab der siebten Woche nach neonataler Infektion mit Mo-NL entwickelten die Tiere eine eitrige Konjunktivitis und Blepharitis, verursacht durch das Bakterium Pasteurella pneumotropica. Die Myristilierungsstelle und das PxxP-Motiv von Nef, das in humanen Zellen die Aktivierung der Pak-Kinase und die Herunterregulierung von MHC-I-Molekülen vermittelt, waren notwendig für die Induktion des Phänotyps. Zur Untersuchung der Immunantwort durch CD4+ und CD8+ T-Zellen nach Infektion mit rekombinanten Viren wurde ein etabliertes System verwendet, in welchem durch subkutane Infektion mit lymphozytärem Choriomeningitis Virus (LCMV) eine delayed type hypersensitivity (DTH) Reaktion in der Fußsohle von Mäusen induziert werden kann. Tiere, die zuvor neonatal mit Mo-NL infiziert worden waren, zeigten im Vergleich zu Kontrolltieren eine reduzierte CD4-vermittelte T-Zellantwort. Die opportunistische Infektion mit P. pneumotropica deuten in Verbindung mit den Hinweisen auf eine teilweise beeinträchtigte T-Zell-Antwort darauf hin, dass Nef in dem beschriebenen Modellsystem Störungen des Immunsystems verursacht.

Translation of abstract (English)

The viral Nef protein is an important determinant for infectivity and pathogenicity of the human and simian immunodeficiency virus. Its importance is underscored by the phenotype of HIV-nef-transgenic mice that develop an AIDS-like disease. To analyze Nef functions in an infectable small animal model, neonatal mice were infected with replication competent Moloney Murine Leukemia Virus encoding HIV-nef (Mo-NL) or a corresponding control (Mo-GFP, Mo). The additional gene did not interfere with the replication of the virus. Titers of recombinant viruses were comparable with wildtype MoMuLV in vitro. The analysis of primary mouse T-lymphocytes revealed, that Nef activated the Pak kinase and downregulated the expression of endogenous CD4 from the cell surface. On this account the pre-conditions for the analysis of recombinant MoMuLV in a mouse model system were provided. Numbers of GFP expressing T-cells in Mo-GFP infected animals were determined by FACS analysis and were detectable for at least 13 weeks. GFP expressing CD4+ T-cells reached up to 60% of all cells in the peripheral blood. Starting at week 7 p. i. almost all of the Mo-NL infected animals developed a purulent conjunctivitis and blepharitis caused by Pasteurella pneumotropica. The myristoylation site and the PxxP motif of Nef that mediates activation of the cellular PAK kinase and MHC-I downregulation in human cells were essential for the induction of the phenotype. To characterize the immune response of CD4+ and CD8+ T-cells after MoMuLV infection, I used a Lymphocytic Choriomeningitis Virus challenge model that induces a delayed type hypersensitivity reaction in the footpad of mice. Animals previously infected with Mo-NL showed a reduced CD4+ T-cell mediated response compared to the corresponding controls. The opportunistic infection by P. pneumotropica together with evidence for a partially impaired T-cell response suggest a Nef-induced immunological disturbance in this model.