German Title: Zur fundamentalen Begrenzung der Bildtiefe in der Zwei-Photonen Mikroskopie

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Abstract

One of the principle advantages of two-photon microscopy over one-photon techniques is that it can provide high-resolution images from very deep within living tissue. While imaging depths of 500 micron in brain tissue have become standard performance, larger depths have been inaccessible mainly due to the power limitation of current femto-second laser sources. Here we investigate strategies to improve the imaging depth in two-photon microscopy. In particular, we show that the two-photon imaging depth can be significantly improved using optically amplified femto-second laser pulses. Using a regenerative amplifier as the excitation source we obtained images of stained vasculature and GFP-labeled neurons down to a depth of about 1000 micron below the brain surface in the cortex of mice in vivo. The maximum imaging depth was now limited by out-of-focus background fluorescence and not by the available excitation power. In order to provide a quantitative description of this behavior, we have investigated the effects of scattering on fluo-rescence excitation and detection. The most prominent parameters that influence the maximum two-photon imaging depth are the excitation numerical aperture and the sample staining charac-teristics. The largest depths can be achieved with the largest excitation numerical aperture and the lowest out-of-focus volume staining.

Translation of abstract (German)

Einer der grundlegenden Vorteile der Zwei-Photonen Mikroskopie gegenüber Ein-Photonen Techniken ist die Möglichkeit der Aufnahme hochauflösender Bilder tief in lebenden Geweben. Obwohl Bildtiefen von 500 Mikron in Gehirngewebe heutzutage Standard sind, sind größere Tiefen aufgrund der limitierten optischen Leistung herkömmlicher Femto-Sekunden Laser unzugänglich gewesen. In dieser Arbeit werden Strategien zur Verbesserung der Bildtiefe in der Zwei-Photo-nen Mikroskopie untersucht. Im Speziellen wird gezeigt, daß, mittels optisch verstärkter Laser Pulse, signifikante Verbesserungen der Bildtiefe möglich sind. Unter Benutzung eines regenera-tiven Laserverstärkers, wurden Bilder von gefärbten Gefäßen und Neuronen im lebenden Gehirn von Mäusen bis zu Tiefen von bis zu 1000 Mikron aufgenommen. In diesen Experimenten war die maximale Bildtiefe nicht mehr durch die maximal verfügbare Laserleistung limitiert sondern durch eine Zunahme in der Hintergrundfluoreszenz. Um dieses Verhalten quantitativ zu be-schreiben, wurde der Einfluß der Lichtstreuung auf die Anregung und Detektion von Fluoreszenz untersucht. Die Parameter mit dem größten Einfluß auf die maximal erreichbare Bildtiefe sind die Numerische Apertur und die Färbecharakteristik des Untersuchungsobjektes. Die größten Bildtiefen werden mit der größten numerischen Apertur und der geringsten Hintergrundfärbung des Untersuchungsobjektes erzielt.