English Title: Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 1: structural and functional characterisation

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Abstract

Veränderungen der cytosolischen Konzentration von Ca2+-Ionen spielen eine Schlüsselrolle bei der Signaltransduktion eukaryontischer Zellen. Ein Anstieg der Ca2+-Konzentration kann die Reaktion auf eine Vielzahl von Stimuli sein und ermöglicht es der Zelle sich veränderten Umweltbedingungen anzupassen. So konnte für Plasmodium falciparum, den Erreger der Malaria tropica, gezeigt werden, dass Calcium sowohl bei der Invasion der Erythrocyten als auch für die intraerythrocytäre Entwicklung der Parasiten essentiell ist. Als mögliche Zielproteine und Vermittler der Ca2+-induzierten Signaltransduktion wurden unter anderem calciumabhängige Proteinkinasen (CDPKs) identifiziert. CDPKs haben in Pflanzen und einigen Spezies der Protozoen, so auch in P. falciparum, eine Schlüsselfunktion bei der Vermittlung calciumabhängiger Phosphorylierungsereignisse inne. Sie sind an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt und ermöglichen es der Zelle, auf zahlreiche Umwelteinflüsse und Stress zu reagieren. CDPKs sind enge Verwandte der Calcium-Calmodulin-abhängigen Proteinkinasen (CaMPK) tierischer Zellen und Pilze. Sie unterscheiden sich aber von diesen durch die Kombination einer katalytischen Serin/Threonin-Proteinkinasedomäne und einer dem Calmodulin verwandten regulatorischen Ca2+-bindenden Domäne in einem Protein. In P. falciparum konnten bisher fünf dem klassischen Typus zuzuordnende CDPKs identifiziert werden. Die P. falciparum calciumabhängige Proteinkinase 1 (PfCDPK1) scheint an der Invasion von Erythrocyten sowie an der Regulation von Membranbiogeneseprozessen beteiligt zu sein. Die herausragende Bedeutung der CDPKs für die Funktion der Zelle und die Tatsache, dass sie nur in Pflanzen und einigen Protozoen wie Plasmodium, nicht aber in tierischen Zellen vorkommen, macht PfCDPK1 zu einem idealen Angriffsziel für die Entwicklung neuer Pharmaka gegen die Malaria tropica, die den Erreger spezifisch bekämpfen, den menschlichen Wirt dabei aber nicht schädigen. Ein Hauptaugenmerk dieser Arbeit richtete sich deshalb auf die Identifizierung eines spezifischen Inhibitors von PfCDPK1, der als Grundlage für die Entwicklung einer neuen pharmakophoren Leitstruktur dienen sollte. Dabei wurden zwei unterschiedliche Wege eingeschlagen. Zum einen wurden in einem High Throughput Screening sowie in eigenen Laborversuchen mehrere Substanzbanken auf mögliche Inhibitoren von PfCDPK1 untersucht. Zum anderen sollte durch die Kristallisation und anschließende Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von PfCDPK1 und der Bindungsverhältnisse im Molekül die Grundlage für ein molecular modelling eines spezifischen Inhibitors gelegt werden. Die Kristallisation von Proteinen stellt hohe Anforderungen an die Reinheit und Homogenität eines Proteins in Lösung. Aus diesem Grunde wurde zunächst eine umfangreiche biochemische Charakterisierung von PfCDPK1 durchgeführt, auf deren Grundlage ein Protokoll für die Expression und Aufreinigung geeigneter Expressionskonstrukte von PfCDPK1 entwickelt wurde. Rekombinantes Protein, das nach diesem Protokoll aufgereinigt war, bildete die Ausgangsbasis für zahlreiche Kristallisationsansätze. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit befasste sich mit den Membranverankerungs- und Zielgebungsmotiven von PfCDPK1. Die Kinase besitzt in ihrem N-Terminus drei Motive, über die eine Membrananheftung erfolgen kann: eine Konsensussequenz für eine Myristylierung, eine mögliche Palmitylierungsstelle und ein Cluster basischer Aminosäuren. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl endogene als auch in vitro translatierte PfCDPK1 myristyliert wird. Darüber hinaus konnte in Membranbindungsstudien mit in vitro translatierter PfCDPK1 bzw. Mutanten mit veränderten Membranankermotiven die Membranbindungsfunktion der Myristylierung und des basischen Aminosäureclusters experimentell bestätigt werden. Die fraktionierte Saponinlyse transient transfizierter Parasiten, welche PfCDPK1 oder eine ihrer Mutanten exprimierten, untermauern diese Beobachtungen. Schließlich sollte mit Hilfe von GFP-Fusionsproteinen der Einfluss der Membranankermotive auf die Lokalisation von PfCDPK1 im infizierten Erythrocyten untersucht werden. Hierzu wurde die N-terminale Signalsequenz von PfCDPK1 und ihrer Mutanten an GFP gekoppelt, die Konstrukte in P. falciparum transfiziert und die Lokalisation der GFP-Konstrukte mittels konfokaler Laser–Scan-Mikroskopie untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass für den Transport der Kinase in die parasitophore Vakuole und von ihr abgeleiteten Membransysteme alle drei Membranbindungsmotive erforderlich sind.

Translation of abstract (English)

Changes in the cytosolic concentration of calcium ions (Ca2+) play a key second messenger role in signal transduction of eukaryotic cells. A rise in the concentration of Ca2+ is a reaction to a multitude of different stimuli and enables the cell to respond to environmental changes. For Plasmodium falciparum, the causative agent of malaria tropica, it has been shown that Ca2+ is essential both for invasion of the red blood cell as well as for the intraerythrocytic development of the parasite. As a possible target and mediator of Ca2+-induced signal transduction, calcium-dependent protein kinases (CDPKs) have been identified. In plants and some protozoa, including P. falciparum, CDPKs are the key enzymes for calcium-dependent phosphorylation events. They are involved in multiple cellular processes and allow the cell to respond to a variety of biotic and abiotic stress stimuli. CDPKs are characterised by the presence of two functional domains within their polypeptide sequence: a serine/threonine protein kinase catalytic domain and a Ca2+-binding regulatory domain similar to calmodulin. In P. falciparum five classical CDPKs have been identified. The P. falciparum calcium dependent protein kinase 1 (PfCDPK1) seems to play a role in red blood cell invasion and the regulation of membrane biogenesis. The outstanding importance of CDPKs for cell function and the fact that they are only found in plants and some protozoal species, but are absent from multicellular organisms of the animal kingdom, makes PfCDPK1 an ideal target for the development of new drugs against malaria tropica, which could specifically combat the parasite without harming the human host. Thus a main attention of this thesis was focussed on the identification of a specific inhibitor of PfCDPK1 which could serve as a lead structure for the development of a novel antimalarial drug. The first approach was based on conventional compound screening. Several compound libraries were screened for PfCDPK1 inhibitors. A major part of this was done in a high throughput screening campaign. The Screening of the derivatives of the hit compounds and the screening of a herbicide library was carried out in our lab. The second approach was based on the identification of a specific inhibitor by molecular modelling. Therefore efforts were made to crystallize PfCDPK1 to enable the elucidation of the 3-dimensional structure and the molecular binding conditions of PfCDPK1 by X-ray diffraction. The crystallization of proteins is rather complex and makes great demands on the purity and homogeneity of a protein in solution. Therefore a thorough biochemical characterisation of PfCDPK1 was carried out, on the basis of which a protocol for the expression and purification of suitable expression constructs was developed. Such recombinant proteins were then used for a multitude of sparse matrix crystal screens. A further aspect of this work focused on the mechanisms involved in the membrane attachment and cellular targeting of PfCDPK1. The kinase contains three motifs for membrane binding at its N-terminus: a consensus sequence for myristoylation, a putative palmitoylation site and cluster of basic amino acids. Endogenous PfCDPK1 and the in vitro translated kinase were both shown to be myristoylated. To characterise the factors involved in membrane attachment, membrane-binding assays of in vitro translated PfCDPK1 and mutant proteins with changes in the membrane anchoring motifs were performed. The supposed membrane attachment function of the basic cluster was experimentally verified and shown to participate together with N-myristoylation in membrane anchoring of the kinase. In a further experiment, these findings could be confirmed for in vivo expressed PfCDPK1 and mutants by fractionated saponine lysis of transiently transfected parasites. Finally the influence of the membrane-binding motifs on the localisation of PfCDPK1 within the infected red blood cell should be determined by using GFP fusion proteins carrying the N-terminal signal sequence of PfCDPK1 or its mutants. The constructs were transfected in P. falciparum and the localisation of the GFP fusion proteins within the infected erythrocyte was analysed by confocal laser scan microscopy. Using this approach it could be demonstrated, that all three membrane binding motifs are required for translocation of PfCDPK1 to the parasitophorous vacuole (PV) and other membranous structures derived from the PV.