English Title: Humanization of murine hybridoma antibodies

Preview

PDF, German Download (2MB) | Terms of use

Abstract

Viele murine Hybridome produzieren therapeutisch interessante Antikörper. Dazu zählt auch der monoklonale Maushybridomantikörper HEA125 (IgG1), der mit hoher Affinität an EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule) bindet. Da EpCAM auf der Oberfläche fast aller humaner epithelialer Tumore stark überexprimiert ist, eignet sich HEA125 ggf. als Therapeutikum für Karzinome. Murine Antikörper sind aber nicht in der Lage, die Effektorfunktionen des menschlichen Immunsystems zu aktivieren. Außerdem werden sie im menschlichen Organismus durch die HAMA (Human Anti Mouse Antibodies) Antwort meist sehr schnell inaktiviert. (A) Deshalb wird in dieser Arbeit am Beispiel von HEA125 ein Weg aufgezeigt, durch den die konstanten Domänen von beliebigen Hybridomantikörpern chimärisiert werden können, wodurch die Wirksamkeit der Antikörper verbessert und gleichzeitig die HAMA Bildung verringert wird. Dafür wurde mittels FACS zunächst ein stabiler Subklon HEA125-1 etabliert, dessen Zellen verglichen mit HEA125 ca. 30% mehr Antikörper auf ihrer Oberfläche exprimieren. Damit können sehr einfach per FACS solche Zellen isoliert werden, die veränderte Antikörper produzieren. Der Austausch der konstanten Domänen geschieht dabei mittels homologer Rekombination. Im Fall der leichten Kette konnte 1 von 3·108 HEA-Huk Zielzellen mittels FACS isoliert werden, deren exprimierte Antikörper statt der ursprünglich murinen nur noch eine humane konstante Kappa Kette aufweisen. An der Chimärisierung der schweren Kette wird noch gearbeitet. Kennzeichen der hier entwickelten Methode ist, dass kein Selektionsmarker benötigt wird, wodurch die Antikörpergene in ihrer ursprünglichen chromosomalen Umgebung erhalten werden. Dies führt zu stabilen und hohen Expressionsraten, wodurch der bisher sehr mühselige Weg zu einem Antikörper Therapeutikum stark verkürzt wird. (B) Ausgehend von der chimärisierten Zelllinie Hu-HEA125 soll außerdem mittels Kassettenaustausch der variablen Antikörperdomänen eine Bibliothek humaner Hybridomantikörper generiert werden. Dafür ist die Einführung von spezifischen Rekombinationsstellen ins Hu-HEA125-Genom durch zwei weitere homologe Rekombinationsereignisse notwendig. Die Einführung der loxP Stellen mittels eines flankierten NPTII Gens in den aktiven IGHV Genlokus wurde bereits erfolgreich in HEA125 getestet. Die homolog rekombinierten Zielzellen konnten mittels PCR nachgewiesen werden, waren aber nicht stabil. Deshalb ist die Einführung der spezifischen Rekombinationsstellen direkt mittels veränderter, FACS-selektionierbarer variabler Domänen geplant. Damit können die murinen variablen Domänen je nach Kassettenaustauschfrequenz gegen die Vielfalt humaner variabler Domänen ausgetauscht werden. Hierbei werden an DNA humaner B-Lymphozyten PCR amplifizierte humane schwere und leichte Ketten zufällig miteinander kombiniert. Aus der resultierenden Vielfalt sollen interessante humane Antikörper nahezu beliebiger Spezifität aufgrund der oberflächenexprimierten Antikörper durch Bindung an immobilisiertes Antigen schnell und einfach isoliert werden können.