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Abstract

Neuroblastoma is a pediatric tumor of the sympathetic nervous system that most commonly affects infants and young children. It is a disease with very variable outcomes, which range from spontaneous regression to aggressive disease. Particularly problematic are high-risk cases after relapse, with only 10% of patients surviving for longer than five years and chemotherapy resistance making treatment difficult. In this thesis, I examined differences between primary and relapsed patient gene expression data and between chemotherapy-sensitive and chemotherapy-resistant neuroblastoma cell lines to find a vulnerability that can be targeted to overcome chemotherapy resistance and lead to cell death. I further investigated which type of cell death was induced. My analysis of gene expression data from primary and relapsed neuroblastoma patients suggested that the ERBB family of receptor tyrosine kinases, particularly ERBB4, plays a role in relapsed high-risk neuroblastomas. The ERBB family is crucial in development and is well known for its link to cancer. Furthermore, I functionally examined the resistance breaking effect of 15 clinically relevant drugs on a neuroblastoma cell line that was treated to be resistant to the standard-of-care chemotherapeutic vincristine (VCR). Tariquidar, an inhibitor of P-glycoprotein (P-gp), and afatinib, a FDA approved inhibitor of the ERBB family, were the two most efficient drugs in breaking resistance in this screen. P-gp/ABCB1 is a transmembrane transporter that very efficiently eliminates drugs and other xenobiotics from the cell and has long been recognized for its contribution to chemotherapy resistance. Analysing gene expression datasets of more than 50 different neuroblastoma cell lines (primary and relapsed) and more than 160 neuroblastoma patient samples from the pediatric precision medicine platform INFORM (Individualized Therapy For Relapsed Malignancies in Childhood) confirmed a crucial role of P-gp in neuroblastoma resistance at relapse. The ERBB family appeared to play a minor part. I mechanistically investigated chemotherapy resistance through four pairs of vincristine- sensitive/resistant neuroblastoma sublines - each pair with the same genetic background - and two additional high-risk neuroblastoma cell lines. I effectively overcame resistance by the addition of the pan-ERBB family inhibitors afatinib and lapatinib, as well as the P-gp inhibitors tariquidar and verapamil, to VCR treatment, which synergistically reduced viability. Functional analyses of the ERBB downstream pathways, as well as ERBB4 knock-down, showed the resistance breaking effect of afatinib to be unrelated to ERBB signaling and suggested an off-target effect on P-gp. ABCB1 knock-down and analysis of transporter function confirmed that resistance was mediated through P-gp. My analysis of programmed cell death, in particular apoptosis and ferroptosis, in neuroblastoma cell lines showed that apoptosis was consistently induced, while ferroptosis contributed to cell death in the IMR-32 cell line. The combination treatments of VCR with afatinib or tariquidar in VCR-sensitive and VCR-resistant cell lines led to cell death by apoptosis. In summary, this study showed that P-gp is an important player in chemotherapy resistance in high-risk, relapsed neuroblastoma. ERBB4, although upregulated in individual cases or cell lines, did not contribute to resistance, and the sensitizing effect of the ERBB family inhibitor afatinib was due to an off-target effect on P-gp. I further showed that both apoptosis and ferroptosis are induced in neuroblastoma cell lines, with apoptosis being the dominant mechanism of cell death when chemotherapy resistance was broken.

Translation of abstract (German)

Das Neuroblastom ist ein pädiatrischer Tumor des sympathischen Nervensystems, der am häufigsten Säuglinge und Kleinkinder betrifft. Es ist eine Krankheit mit sehr unterschiedlichen Auswirkungen, die von spontaner Regression bis zu aggressiver Krankheit reichen. Besonders problematisch sind Hochrisikofälle nach Rückfällen, bei denen nur 10 % der Patienten länger als fünf Jahre überleben und Chemotherapieresistenzen die Behandlung erschweren. In dieser Doktorarbeit untersuchte ich Unterschiede zwischen Genexpressionsdaten von primären und rezidivierten Patienten sowie zwischen Chemotherapie sensitiven und resistenten Neuroblastom Zelllinien, um eine Angriffspunkt zu finden, der gezielt zur Überwindung der Chemotherapieresistenz und zum Zelltod führen kann. Zudem untersuchte ich, welche Art von Zelltod dadurch ausgelöst wurde. Meine Analyse der Genexpressionsdaten von Patienten mit primärem und rezidiviertem Neuroblastom wies darauf hin, dass die ERBB-Familie von Rezeptortyrosinkinasen, insbesondere ERBB4, eine Rolle im rezidiviertem Hochrisiko-Neuroblastom spielt. Die ERBB-Familie spielt in der Entwicklung eine entscheidende Rolle und ist für ihre Verbindung zu Krebs bekannt. In einem zweiten Ansatz untersuchte ich funktionell die resistenzbrechende Wirkung von 15 Medikamenten auf eine Neuroblastomzelllinie, die gegen das Chemotherapeutikum Vincristin (VCR) resistent gemacht worden waren. Tariquidar, ein Inhibitor des P-glycoproteins (P-gp), und Afatinib, ein Inhibitor der ERBB-Familie, brachen in diesem Screen am effizientesten die Chemotherapieresistenz. P-gp/ABCB1 ist ein Transporter der Zellmembran, der Medikamente sehr effizient aus der Zelle heraustransportiert und seit langem für seinen Beitrag zur Chemotherapieresistenz bekannt ist. Die weitere Untersuchung, welchen Beitrag ERBB4 zur Resistenz leistet, zeigte, dass ERBB4 nicht generell hochreguliert ist, jedoch einzelne Patienten und Zelllinien die Expression von ERBB4 bei einem Rückfall oder bei der Entwicklung von Resistenz erhöhten. Die Behandlung mit Afatinib sensibilisierte resistente Neuroblastom-Zelllinien für VCR und führte zu einer synergistischen Verringerung der Viabilität. Funktionsanalysen der ERBB Signalwege sowie ein ERBB4 Knockdown zeigten jedoch, dass dieser resistenzbrechende Effekt nicht mit den ERBB Signalwegen zusammenhängt, und deuten auf einen Off-Target-Effekt von Afatinib auf P-gp hin. P-gp war bei rezidivierten Neuroblastompatienten oder resistenten Zelllinien konsistenter hochreguliert als ERBB4. Tariquidar Behandlung der VCR-resistenten Neuroblastomzellen, erhöhte die Sensitivität zu VCR und verringerte synergistisch die Viabilität. Der ABCB1 Knockdown und die Analyse der Transporterfunktion bestätigten, dass die Resistenz durch P-gp vermittelt wurde. Meine Analyse der programmierten Zelltodmechanismen Apoptose und Ferroptose in Neuroblastomzelllinien zeigte, dass Apoptose durchgehend induziert wurde, während Ferroptose zum Zelltod in der Zelllinie IMR-32 beitrug. Die Kombinationsbehandlungen von VCR mit Afatinib oder Tariquidar in den VCR-sensitiven und -resistenten Zelllinien führten zum Zelltod durch Apoptose. Zusammenfassend zeigte diese Studie, dass P-gp eine wichtige Rolle bei der Chemotherapieresistenz von rezidivierten Hochrisiko-Neuroblastomen spielt. Obwohl ERBB4 in Einzelfällen hochreguliert war, trug es nicht zur Resistenz bei, und die sensibilisierende Wirkung des ERBB Inhibitors Afatinib war auf einen Off-Target-Effekt auf P-gp zurückzuführen. Ich habe ferner gezeigt, dass sowohl Apoptose als auch Ferroptose in Neuroblastomzelllinien induziert werden, wobei Apoptose der dominierende Mechanismus des Zelltods war, wenn die Chemotherapieresistenz gebrochen wurde.