English Title: Ectopic expression of Nt-CIF and Nt-VIF in potato (Solanum tuberosum) : posttranslational inhibition of wound-induced cell wall invertase and vacuolar invertase activity in vivo

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Abstract

Die in unterschiedlichen Kompartimenten der Pflanzenzelle lokalisierten Invertasen katalysieren im pflanzlichen Metabolismus die irreversible Hydrolyse der Saccharose in Glukose und Fruktose. Die Enzyme spielen eine wichtige Rolle bei Transportvorgängen, der Osmoregulation und innerhalb von Stressantworten. Verwundung verursacht in Pflanzen die Expression von Invertasen, die Funktionen welche sie innerhalb der Antwort auf Verwundung einnehmen, sind jedoch nicht vollständig geklärt. Zur Aufklärung der Funktion(en) der Zellwandinvertase (ZWI) und der vakuolären Invertase (VI) bei Verwundung von Kartoffelknollengewebe wurden innerhalb der vorliegenden Arbeit transgene Kartoffelpflanzen mit ektopischer Expression der Tabak-Invertaseinhibitoren Nt-CIF (Nicotiana tabacum Cell wall Inhibitor of ß-Fructosidase/ ZWI-Inhibitor) und Nt-VIF (Nicotiana tabacum Vacuolar Inhibitor of ß-Fructosidase/ VI-Inhibitor) eingesetzt. Die Expression der Inhibitorproteine bedingt die posttranslationale Inhibition der ZWI-Aktivität in den Nt-CIF-Transformanten, bzw. der VI-Aktivität in den Nt-VIF-Transformanten, übt jedoch keinen Einfluss auf die Expression beider Invertasetranskripte und -proteine (VI, ZWI) aus. Die Inhibition der Invertasen verursacht eine nahezu vollständige Unterdrückung der wundbedingten Hexosebildung (Glukose/Fruktose) in Nt-VIF-Transformanten und eine Verzögerung der Hexosebildung in Nt-CIF-Transformanten im Vergleich zum Wildtyp. Da Zucker als Signale innerhalb des pflanzlichen Metabolismus fungieren und die Genexpression beeinflussen, wurde eine vergleichende Analyse des durch Verwundung induzierten Metabolismus zwischen Wildtyp und den Transformanten durchgeführt. Untersucht wurde die wundinduzierte Expression von Enzymen des Kohlenhydratmetabolismus (Saccharose-Phosphat-Synthase, Saccharose-Synthase, Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase), die Expression von Enzymen und die Konzentration von Metaboliten des sekundären Stoffwechsels (Phenylalaninammoniumlyase (PAL), Konzentration löslicher Phenole), die Wundperidermbildung und die Respirationsrate. Aus diesen Untersuchungen gewonnene Ergebnisse zeigten, dass die posttranslationale Inhibition der Invertasen in den Nt-VIF- und Nt-CIF-Transformanten die Wundreaktion nicht beeinträchtigt. Bezugnehmend auf die Unterdrückung der wundbedingten Hexosebildung in Nt-VIF-Transformanten ein wichtiger Befund für deren biotechnologische Nutzung. Parallel an Kartoffelknollen des Wildtyps und der Transformanten wurde zudem die tumorerzeugende Infektion mit Agrobacterium tumefaciens (A.t.) durchgeführt, da ZWI möglicherweise als Schlüsselenzym innerhalb der Tumorinduktion fungiert. Die Studien an A.t.-Tumoren der Nt-CIF-Transformanten, welche eine Reduktion der ZWI-Aktivität in vivo aufweisen, ergaben wichtige Hinweise zur Rolle der ZWI in Tumorgewebe. Die Expression des Inhibitors in den Nt-CIF-Transformanten war jedoch nicht ausreichend zur A.t.-induzierte ZWI-Expression. Die ZWI-Aktivität war daher in diesen Transformanten im Tumorgewebe nicht signifikant inhibiert.

Translation of abstract (English)

Plant invertases are located in different compartments of the cell and catalyse the cleavage of sucrose to glucose and fructose. The enzymes are involved in source-sink regulation, phloem transport of carbohydrates, osmoregulation and in stress responses. Wounding causes the expression of invertases, their functions in wound response is still not fully understood. To investigate the functions of wound-induced cell wall invertase and vacuolar invertase in potato tubers we used transgenic potato plants with ectopic expression of Nt-CIF (Nicotiana tabacum Cell wall Inhibitor of ß-Fructosidase/ cell wall invertase inhibitor) and Nt-VIF (Nicotiana tabacum Vacuolar Inhibitor of ß-Fructosidase/ vacuolar invertase inhibitor). The inhibitor expression causes the posttranslational inhibition of cell wall invertase activity in Nt-CIF-transformants and vacuolar invertase activity in Nt-VIF-transformants. The determination of the content of sucrose, glucose and fructose in Nt-VIF-transformants reveals a suppression of the wound induced hexoses and in Nt-CIF-transformants a delayed production of hexoses compared to wild type potato tubers. In plant metabolism sugars are involved in sugar-signalling-pathways and are able to influence gene expression. To analyse the functions of sugars in wound response, we investigated the transformants and the wild type potato tubers in terms of expression of wound induced phenylalaninammoniumlyase (PAL), the content of soluble phenolics, formation of wound periderm and wound respiration rates. Furthermore we determined the expression of enzymes involved in carbohydrate metabolism (sucrose-phosphate-synthase, sucrose-synthase, glucose-6-phosphate-dehydrogenase). Finally there is no detectable difference between wild type and the transfomants, demonstrating that the posttranslational inhibition of the invertases does not influence wound response. Parallel examinations with wild type potato tubers and Nt-CIF- and Nt-VIF-transformants infected with Agrobacterium tumefaciens (A.t.) should explain the function of cell wall invertases in tumor induction. Cell wall invertase is regarded as a key enzyme in this process. The analysis of tumors of Nt-CIF-transformants, which display an inhibition of cell wall invertase in vivo, gave some hints to the function of cell wall invertase in tumor induction. The A.t.-induced tumors show a highly increased cell wall invertase activity in wild type and transformants. The inhibitor expression, under control of the CaMV 35S promoter in the transformants is not able to repress the invertase activity completely.