German Title: Identifikation eines funktionalen mRNA-miRNA Netwerks in mTEZ Entwicklung

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Abstract

The adaptive immune system with its diversity of immune cells and their receptors allows an effective fight against a plethora of pathogens. The development of T cells is taking place in the thymus, where it undergoes two selections that is immensely important to ensure self-tolerance. For those two strictly regulated selection processes there are two major cell components being responsible for that called cortical thymic epithelial cells (cTEC) and medullary thymic epithelial cells (mTEC). MTECs are playing an important role for the prevention of autoimmune diseases as they express self-antigens to the maturing T cells. The current knowledge describes basically the function of cTECs and mTECs, the development of a stem cell to mTEC, the involvement of molecular mechanisms which influences the development of thymus and mTECs, still not in every single details. To date molecular details are still missing how an immature mTEC develops to a mature mTEC, especially molecular mechanisms, which influence the maturation and what controls each single step to its final maturation. Previous researches have found in the immature mTECs four new subpopulations present in fetal and embryonic mTECs, which have not been shown in adult mice. Until now only a handful of microRNAs (miRNAs) have been found to play a role in mTECs, but no miRNAs have been founds to play an active role in the maturation process of mTECs. The scope of this doctorate thesis was to characterise the four subpopulations in adult mice with the help of mRNA and miRNA microarray analyses. With the help of the mRNA gene arrays we could decipher a lineage sequence within the four subpopulations stating that Sca1 as the most progenitor population Sca-1 < DP < CD24 < DN. According to the analyses DN was the closest cell population to mature mTECs, probably one step before coming a mature mTEC. Thereupon we used bioinformatics to filter the most prominent miRNAs, which might play an important role in the development of the four subpopulations. Those miRNAs were verified by using a SCID mouse model, which emulates the dynamic development of the four subpopulations. Subsequently we inhibited or overexpressed those miRNA candidates in freshly isolated mTECs to see their influence of the development of the four subpopulations. At the end we found 11 promising miRNAs that play a role in the maturation of the four subgroups. This finding resulted in a deeper search for possible mRNA interaction partners for those miRNA candidates. After investigating 35 mRNAs we found 4 miRNA-mRNA interactions, which have not been described in the mTEC development before. Following miRNA-mRNA networks have been found: miR-34a interacts with Foxp1, Mir-125b-5p with Bak1 and Mapk14, miR-125a-3p with Fam83e. This thesis completes the understanding of the four subpopulations in adult mice as well discovered 4 new miRNA-mRNA interactions, which are important for the maturation of the four subpopulations. With this newly gained knowledge we can apply it to the human thymus and their mTEC development with the hope to boost the thymus function after chemotherapy and organ transplantations.

Translation of abstract (German)

Das adaptive Immunsystem gewährleistet mit seinem breiten Spektrum an Immunzellen und deren Rezeptoren eine effektive Bekämpfung von einer Vielzahl von Pathogenen. Die T-Zell Generierung, welche im Thymus stattfindet, durchläuft einer zweistufigen Selektion, welche für die immunologische Selbsttoleranz essentiell ist. Für diese strikte Kontrolle der beiden Selektionen spielen vor allem zwei große Zellpopulationen eine wichtige Rolle, die kortikalen thymischen-Epithel-Zellen (kTEZ) und die medullären thymischen-Epithel-Zellen (mTEZ). Für die Vorbeugung von Autoimmunreaktionen spielt die Einbindung der mTEZ eine entscheidende Rolle, da diese periphere Selbst-Antigene exprimieren und diese den reifenden T-Zellen präsentieren. Die bisherigen Kenntnisse beschreiben die jeweiligen Funktionen der kTEZ und mTEZ, die Entwicklung einer Stammzelle bis zur Entwicklung einer mTEZ, bis hin zu welche molekularen Mechanismen die Entwicklung beeinflussen, aber bislang nicht in kleinsten Details. Bisher wurde der Sprung einer nicht unreifen mTEZ zu einer maturierten mTEZ nicht hinzureichend charakterisiert. Vorausgegangene Forschungen haben gezeigt, dass in fötalen und embryonalen unreifen mTEZ vier Subpopulationen zu finden sind, welche in adulten mTEZ bisher nicht beschrieben wurden. Bisher wurde die Existenz einer Handvoll microRNAs (miRNA), die eine Rolle in mTEZ spielen, entdeckt, aber keine miRNAs entdeckt, die für die Entwicklung der unreifen mTEZ zu reifen mTEZ eine entscheidende Rolle spielen. Im Rahmen der Doktorarbeit wurden die vier Subpopulationen in adulten mTEZ mit Hilfe von miRNA und mRNA Genexpressionsanalysen charakterisiert. Dabei wurde folgende Entwicklungssequenz der vier Subpopulationen aus den unreifen mTEZ anhand der mRNA Genexpression ermittelt Sca-1 < DP < CD24 < DN. DN war laut den Analysen die Vorstufe von reifen mTEZ. Daraufhin wurden mit Hilfe verschiedener bioinformatischen Methoden miRNAs herausgefiltert, die für die Entwicklung der vier Subpopulationen eine entscheidende Rolle spielen. Diese miRNA wurden mit Hilfe eines anderen Mausmodels verifiziert, welche die dynamische Entwicklung der vier Subpopulationen nachahmt. Darauffolgend wurden die potentiellen miRNAs in frisch isolierten unreifen mTEZ inhibiert oder überexprimiert um deren Einfluss bei der Entwicklung der vier Subpopulationen zu untersuchen. Am Ende haben wir 11 miRNAs gefunden, die eine funktionelle Rolle bei der Reifung der 4 Subgruppen spielen. Mit dieser Erkenntnis haben wir mRNAInteraktionspartner der miRNAs gesucht, die für diesen Entwicklungsprozess wichtig sind. Nachdem 35 mRNAs untersucht wurden, stachen am Ende vier miRNA-mRNA-Interaktionspaare hervor, die bisher nicht in mTEZ beschrieben wurden. Folgendes Interaktionspartner wurden gefunden: miR- 34a mit Foxp1, Mir-125b-5p mit Bak1 und Mapk14, miR-125a-3p mit Fam83e. Die Arbeit vervollständig das Wissen über die Entwicklungslinie der zuvor gefundenen vier Subpopulationen in adulten Mäusen und gibt Ausschluss über neue miRNA und mRNA- Interaktionspartnern, die bei der Entwicklung der vier Subpopulationen von Wichtigkeit sind. Darüberhinaus können diese Erkenntnisse auf den humanen Thymus und deren MTEZ Entwicklung übertragen werden und im Hinblick auf Thymus-Regeneration eine äußerst wichtige Rolle spielen, vor allem nach Chemotherapie und Organtransplantationen.