German Title: Herstellung von dual-funktionalisierten Oberflächen für die kovalente Immobilisierung von BMP-6 und adhäsiven Liganden für biologische Anwendungen

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Abstract

The median age of our population causes osteoporosis, bone fractures and disorders, which are also caused by multiple myeloma. In the past 25 years, regenerative medicine had gained in importance, especially for regeneration and renewal of bone tissue, which consists of different cell types composed in a very complex architecture. The growth factor bone morphogenetic protein 6 (BMP-6) belongs to the transforming growth factor β (TGF- β) superfamily and it induces the differentiation of mesenchymal stem cells into mature osteoblasts in bone leading to new bone formation. Besides induction of osteogenic differentiation, BMP-6 is also known to induce cell death in multiple myeloma cells in high concentrations. However, a systemic application is not practicable, since uncontrolled diffusion causes a wide range of side-effects. Immobilization of growth factors allows local treatment of bone fractures and defects, while it prevents uncontrolled release of growth factors. Furthermore, the required amount of growth factors can be reduced tremendously. The objective of this work was the covalent immobilization of BMP-6 co-presented with clicked integrin ligands on a structured gold nanoparticle (AuNP) platform, using blockcopolymer micellar nanolithography (BCMN) developed by Prof. Spatz and co-workers, to study integrin signaling in connection with growth factor responses. BMP-6 was selectively bound to gold nanoparticles organized in a hexagonal structure on the surface allowing to control the amount and density on the surface. I showed that surface co-presentation of BMP-6 and RGD or α5β1 integrin selective ligand promotes SMAD1/5 phosphorylation and osteogenic differentiation of the standard model system C2C12, even at amounts as low as 1 ng, whereas soluble BMP-6 application is significantly less effective. Additionally, BMP-6 was immobilized on gold nanostructured polyethylene glycol diacrylamide (PEG-DA) hydrogels containing different concentrations of cRGD in order to study the influence of the stiffness on the cell signaling. Furthermore, this approach was used to investigate the effect of immobilized BMP-6 in low doses on the multiple myeloma cell line OPM-2 to induce cell death. This approach provides for the first time the successful presentation of BMP-6 in small and defined amounts on surfaces in combination with adhesive ligands. Furthermore, covalent immobilization hinders protein release while maintaining the biological activity of the growth factor.

Translation of abstract (German)

Das durchschnittliche Alter unsere Bevölkerung verursacht Osteoporose, Knochenfrakturen und -fehlbildungen, welche auch durch das Multiple Myelom verursacht werden. In den vergangenen 25 Jahren hat die regenerative Medizin an Bedeutung gewonnen, insbesondere für die Regeneration und die Erneuerung von Knochengewebe, welches sich aus verschiedenen Zelltypen in einer sehr komplexen Struktur zusammensetzt. Der Wachstumsfaktor Bone Morphogenetic Protein 6 (BMP-6, knochenmorphogenetisches Protein 6) gehört zu der transformierenden Wachstumsfaktoren β (Transforming Growth Factor β, TGF-β) Superfamilie, und es initiiert die Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen in reife Osteoblasten, was zur Knochenneubildung führt. Neben der Initiierung der osteogenen Differenzierung ist BMP-6 auch bekannt dafür, dass es in hohen Konzentrationen den Zelltod in multiplen Myelomzellen herbeiführt. Eine systemische Behandlung ist jedoch nicht praktikabel, da eine unkontrollierte Diffusion eine Reihe von Nebenwirkungen verursacht. Die Immobilisierung von Wachstumsfaktoren erlaubt die lokale Behandlung von Knochenfrakturen und –defekten, während sie auch die unkontrollierte Freisetzung von Wachstumsfaktoren verhindert. Des Weiteren kann die benötigte Menge an Wachstumsfaktoren drastisch verringert werden. Das Ziel dieser Arbeit war die kovalente Immobilisierung von BMP-6 auf einer goldnanostrukturierten Plattform, unter Verwendung von block-copolymer micellar nanolithography (BCMN) entwickelt von Prof. Spatz und Mitarbeitern, zusammen mit integrinselektiven Liganden, was die Erforschung von Integrinsignalisierung in Verbindung mit Reaktionen auf Wachstumsfaktoren ermöglicht. BMP-6 wurde selektiv an Goldnanopartikel gebunden, welche auf der Oberfläche hexagonal organisiert sind. Dies ermöglicht es, die Menge und die Dichte auf der Oberfläche zu kontrollieren. Ich konnte zeigen, dass die Oberflächencopräsentation von BMP-6 und cRGD bzw. dem α5β1 Integrin selektiven Liganden in Mengen von weniger als 1 ng die SMAD 1/5 Phosphorylierung und die osteogenen Differenzierung in dem Standardmodellsystem C2C12 fördert, während das gelöste BMP-6 signifikant weniger effektiv war. Um den Einfluss der Steifigkeit auf die Zellsignalisierung zu untersuchen, wurde BMP-6 auf Polyethylenglykoldiacrylamid (PEGDA) Hydrogele mit einer goldnanostrukturierten Oberfläche und cRGD in verschiedenen Konzentrationen immobilisiert. Darüber hinaus wurde dieses Konzept für die Untersuchung des Effekts von gering dosierten, immobilisierten BMP-6 auf die multiple Myelom Zelllinie OPM-2 eingesetzt mit der Absicht den Zelltod zu initiieren. Dieses System ermöglicht zum ersten Mal die erfolgreiche Präsentation von BMP-6 auf Oberflächen in kleinen und definierten Mengen in Kombination mit adhäsiven Liganden. Des Weiteren verhindert die kovalente Immobilisierung eine Proteinfreisetzung, während die biologische Aktivität des Wachstumsfaktors erhalten bleibt.