English Title: Use of Erwinia tasmaniensis and Bacillus amyloliquefaciens as bacterial antagonists for biological control of Fire Blight

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Abstract

Erwinia tasmaniensis und Bacillus amyloliquefaciens sind Antagonisten, die in Ko-Kultur eine vergleichbare Hemmwirkung auf den Feuerbranderreger Erwinia amylovora aufweisen. Unter Zugabe von Kulturüberständen der Antagonisten bei Anzucht von E. amylovora bestätigten sich Unterschiede in den potentiellen Wirkmechanismen der beiden Antagonisten. Während B. amyloliquefaciens Toxine mit einem hemmenden Effekt auf E. amylovora produziert, beruht die Wirkung von E. tasmaniensis auf dem Konkurrenzprinzip um vorhandene Nährstoffe, eine Toxinbildung ist für diesen Antagonisten nicht nachgewiesen. Zwischen verschiedenen Isolaten der Art B. amyloliquefaciens konnten vergleichbare Hemmeffekte beobachtet werden. In Hinblick auf eine Anwendung der Antagonisten in der Praxis wurde im Labor und Freiland mit formulierten Produktmustern gearbeitet. Die Formulierung der Antagonisten hatte keinen negativen Einfluss auf deren Wachstum und war mit dem Wachstum von nicht-formulierten Zellen vergleichbar. Unterschiede zeigten sich bei der Lagerstabilität: Während die Sporen von B. amyloliquefaciens bis zu zwei Jahren stabil gelagert werden konnte, war beim formulierten E. tasmaniensis nach wenigen Wochen ein rascher Abfall der Lebendzellzahl bei RT zu beobachten. Die Lagerung bei 4°C ermöglichte eine stabile Aufbewahrung von E. tasmaniensis von bis zu neun Monaten. Auf der Blüte, dem primären Einsatzort des Antagonisten, zeigten B. amyloliquefaciens max. 50% und E. tasmaniensis max. 80% Wirkungsgrad von im Laborassay. Die Entwicklung der Antagonisten auf der Blüte war vergleichbar, es zeigte sich allerdings ein deutlicher Unterschied bezüglich der maximalen Zelldichte. Im Fall von B. amyloliquefaciens war diese 10 bis 100-fach geringer als die von E. tasmaniensis. Untersuchungen zum Sporenanteil auf der Blüte ergaben, dass 24 h bis 36 h nach der Applikation von B. amyloliquefaciens FZB42 die Zellen sporulieren. Im Freiland konnte E. tasmaniensis in drei Jahren, auch bei hohem Feuerbrandbefall, konstante Wirkungsgrade von ca. 60% erreichen. Die Wirkung von B. amyloliquefaciens war stark von der Zugabe von Additiven abhängig und lag bei ca. 50%. Die Bestimmung von Eigenschaften, die eine Rolle beim Antagonismus spielen, ist ein wichtiger Aspekt für die Selektion. Dazu zählt auch die Anpassung an den Lebensraum auf der Blüte. Der genetische Hintergrund einer Transposonmutante von E. tasmaniensis mit einem auffälligen Phänotyp bezüglich Adhäsion und Pigmentbildung wurde genauer untersucht und auf homologe Eigenschaften in E. amylovora überprüft. Für eine effektivere Vorselektion potentieller Feuerbrandantagonisten wurde mit der Entwicklung eines in planta Screenings im 96-Well Format begonnen.

Translation of abstract (English)

Erwinia tasmaniensis and Bacillus amyloliquefaciens are bacterial antagonists with similar inhibitory effects on the Fire Blight pathogen Erwinia amylovora in co-culture. Application of the antagonists’ supernatants to growing E. amylovora cells confirmed differences in the potential modes of action of both antagonists. Whereas B. amyloliquefaciens produces toxins with inhibitory effects on E. amylovora, the antagonism of E. tasmaniensis is based on competition for nutrients and no toxin production could be detected. Similar efficiencies have been observed between isolates of the species B. amyloliquefaciens. With regard to the practical application of these antagonists, formulated product samples were used in laboratory and field experiments. There was no disadvantage of formulated cells concerning growth in comparison to growth of non-formulated cells. However, both antagonists differed in their storability: Whereas spore formulations of B. amyloliquefaciens could be stored for at least two years without disadvantages, formulated E. tasmaniensis cells showed a rapid decrease in living cell counts when kept at RT for a few weeks. Storage at 4°C allowed the maintenance of a stable number of living cells for at least nine months. On the flower, the primary point of use for antagonists in Fire Blight control, B. amyloliquefaciens and E. tasmaniensis reached maximal efficiencies from 50% to 80% in vitro. The development of cells on the flower was similar between both antagonists. However, B. amyloliquefaciens revealed a difference regarding maximal cell numbers on the flowers. Final densities of B. amyloliquefaciens were 10 to 100-fold lower than E. tas-maniensis. Examination of the amount of spores on the flower showed, that 24 h to 36 h post application of B. amyloliquefaciens cells began to sporulate. In field trials E. tasmaniensis was able to reach constant efficiencies of approx. 60% in three years, even at high infestation levels. The efficiency of B. amyloliquefaciens strongly depended on the application of additives and reached a maximum of approx. 50%. The determination of features which play a role in antagonism is an important aspect for the selection of candidates in biological control of Fire Blight. These include antagonist-plant interactions as well as adaptation to the living space on the flower. The genetic background of an E. tasmaniensis transposon mutant, which showed a conspicuous phenotype regarding ad-hesion and pigment formation, was examined. A similar function of the impaired gene was also investigated in E. amylovora. The development of an in planta screening system in a 96-well format was started in this work to contribute for a more effective pre-selection of potential Fire Blight antagonists.