English Title: Experiments on the influence of DNA superhelicity on the structure and stability of nucleosomes and internal DNA-dynamics

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Abstract

Die DNA im Chromatin einer Zelle steht ständig unter Torsionsspannung, da ein großer Teil dieser DNA in negativ superhelikalen Windungen um Histonoktamere herum vorliegt. Positive wie auch negative Torsionsspannung wird auch z.B. während der Elongationsphase der Transkription aufgebaut. Sie steuert die Zugänglichkeit nukleosomaler DNA, ändert die Struktur genregulatorischer Elemente und führt zu Änderungen der Segmentbeweglichkeit ("interne Dynamik") der DNA.

In dieser Dissertation wurde der Einfluss der Torsionsspannung der DNA auf die Struktur und Stabilität von Nukleosomen untersucht. Plasmide mit biochemisch eingestellter Torsionsspannung und auf ihnen rekonstituierte Nukleosomen, wurden hierfür als experimentelles Modellsystem verwendet. Damit kann einerseits die Struktur der Plasmide und Nukleosomen durch Bindung an eine Oberfläche und Bildgebung mittels Rasterkraftmikroskopie (SFM) untersucht werden. Andererseits lässt sich ihr Verhalten in Lösung mittels Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) beobachten. Für die FCS-Messungen wurden einzelne Histonproteine fluoreszent markiert. Dies erlaubte es, mit Hilfe von salzinduzierter Destabilisierung, die Stabilität von Nukleosomen in Abhängigkeit der Torsionsspannung auf dem Plasmid zu untersuchen.

Hierbei zeigte sich, dass ein Übergang von negativer zu positiver Torsionsspannung die Nukleosomenintegrität schwächt. Mittels SFM-Bildgebung konnte weiterhin gezeigt werden, dass sich die Nukleosomenstruktur mit abnehmender negativer Torsionsspannung und dem Auftreten von positiver Torsionsspannung öffnet.

In weiteren Experimenten wurden spezifische Stellen auf den Plasmiden mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Hierdurch war es möglich die globale und interne Dynamik der Plasmide auf unterschiedlichen Zeitskalen zu beobachten. In dieser Arbeit wurde mit der beschriebenen Methode der Einfluss der Superhelizität selbst auf die interne und globale Dynamik, sowie der Einfluss der Ionenstärke der Lösung auf selbige untersucht. Die Ergebnisse erweitern ältere Messungen mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) und bestätigen einige Simulationsergebnisse experimentell.

Es werden außerdem zwei weitere biologisch relevante Effekte auf die interne DNA-Dynamik untersucht: das Verhalten der DNA in unterschiedlich viskosen Medien und bei der Verpackung in Nukleosomen. Die erhöhte Viskosität führte durch unterschiedliche Verlangsamung der internen DNA-Segmentbewegung und der Gesamtbewegung des Plasmids zu einer Trennung beider Bewegungsmodi mit steigender Viskosität. Mit ansteigender Zahl an Nukleosomen auf dem Plasmid wurde einerseits, durch die Kompaktierung der DNA, die translationale Diffusion beschleunigt. Andererseits kam es hier auf sehr kurzen Zeitskalen zu einer Beschleunigung der internen DNA-Segment-Bewegungen.

Translation of abstract (English)

The DNA in chromatin is constantly under torsional stress. Most of it is wound around histone octamers forming one negative supercoil per nucleosome. Positive and negative torsional strain is built up within the DNA during transcription elongation. It regulates the accessibility of nucleosomal DNA, changes the structure of gene-regulatory DNA-Elements, and changes the segmental motion within the DNA.

In this thesis, the impact of torsional strain on nucleosome structure and stability was assessed. Plasmids differing in their superhelical density and optionally carrying different numbers of nucleosomes were used as a model system. This way, changes in the structure of the plasmids and nucleosomes can be observed using scanning force microscopy (SFM). In addition, the behaviour of the plasmids in solutions can be observed by fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Single histone proteins were labelled fluorescently for the FCS measurements. The influence of torsional strain on the stability of nucleosomes was assessed using salt-induced destabilisation in combination with FCS. The transition from negative to positive supercoiling resulted in a decrease of the nucleosome integrity. SFM imaging revealed an opening of the nucleosome structure with decreasing negative torsional strain and the occurrence of positive strain.

Specific sites on the plasmids were labelled fluorescently for additional experiments. This way it was possible to observe changes in the global and internal DNA dynamics of these plasmids for different timescales. This method was used to measure the influence of torsional strain and of the ionic strength of the solution on the DNA dynamics. The results presented in this thesis extend older measurements that were obtained with dynamic light scattering and experimentally confirm the data found in simulations.

Additionally two biologically relevant parameters were tested for their influence on the DNA dynamics: the influence of increasing solution viscosity and of nucleosome formation. The internal and global regimes of the DNA-dynamics were separated with increasing viscosity, due to their disproportionate deceleration. In the second set of the experiments, the translational diffusion was found to increase with higher nucleosome numbers per plasmid. An acceleration of the segmental mobility was observed for very short timescales.