English Title: Fluorescence fluctuation microscopy : design of a prototype, theory and measurements of the mobility of biomolecules in the cell nucleus

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Abstract

Die Theorie der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) wird für Anwendungen in lebenden Zellen erweitert. Zellen enthalten statistisch organisierte Polymere, Membransysteme und geschlossene Kompartimente, die zu behinderter oder anomaler Diffusion führen. Es wird gezeigt, wie der Einfluss von Bindung an zelluläre Strukturen in FCS-Messungen berücksichtigt werden kann. Desweiteren wird ein Aufbau zur kombinierten FCS und konfokalen Laserscanningmikroskopie (CLSM) vorgestellt, das Fluoreszenzfluktuationsmikroskop (FFM). Es wird im Hinblick auf Auflösungsvermögen und Abbildungseigenschaften charakterisiert. Anschließende FCS-Messungen von EGFP und einer EGFP-Chimäre in Zellen zeigen behinderte Diffusion vor allem im Kern mit einer im Vergleich zu Wasser etwa 4fach höheren intrazellulären Viskosität. Aus weiteren Experimenten mit angefärbtem Chromatin und Testmolekülen verschiedener Größe folgt, dass der Einfluss des Chromatins auf die Diffusion von der Teilchengröße abhängt. Auch die Beweglichkeit funktioneller Proteine wird anhand des Transkriptionsterminationsfaktors TTF-I untersucht. Er ist im Nukleolus gebunden und im Rest des Kerns beweglich. Die Lebensdauer des gebundenen Zustands beträgt ca. 27 s.

Translation of abstract (English)

The theory of fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is expanded for the application in living cells. Cells contain statistically organized polymers, membranes, and closed compartments leading to obstructed or anomalous diffusion. The impact of binding to cellular structures on FCS is also considered. In addition, an experimental setup combining FCS and confocal laser scanning microscopy (CLSM) is presented, the fluorescence fluctuation microscope (FFM). Resolution and imaging properties are characterized. Subsequent FCS experiments of EGFP and an EGFP chimera in cells show obstructed diffusion mainly in the nucleus with an approximately 4fold larger intracellular viscosity compared to water. Further experiments with labeled chromatin and tracer molecules of various sizes reveal that the impact of chromatin on diffusion properties depends on the size of the tracer. Finally, the mobility of a functional protein, the transcription termination factor TTF-I, is investigated. Bound in the nucleolus, it is freely mobile in the remainder of the nucleus. The life time of the bound state is about 27 s.