German Title: Charakterisierung von Zell-Matrix-Interaktionen während der Differenzierung von mulitpotenten mesenchymalen Stromazellen

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Abstract

For their huge variety of functions mesenchymal stromal/stem cells (MSCs) are attractive candidates for tissue engineering and cell therapy. Although in vitro differentiation of MSCs is well established and has been extensively studied, little is known about stem cell niches. So how are these niches defined in tissues and which cell-matrix contacts determine the fate of MSCs therein? To approach this task, herein the adhesive behavior of MSCs was evaluated under varying conditions employing non-invasive impedance monitoring in real-time, using fibroblast and keratinocytes as non-specific controls. Major focus was on changes in adhesion and migration of MSCs induced to differentiate into adipogenic and osteogenic lineages, the effects of extracellular matrix (ECM) contacts on this response, and the correlation of impedance profiles with specific differentiation markers including the predictive value of these recorded profiles. Finally, the influence of the MSC source was evaluated by comparing different cell populations derived from bone marrow and fat tissue. MSCs roughly resembled fibroblast adhesion while keratinocytes differed significantly, which was reflected by impedance recordings. Inducing differentiation, impedance profiles of MSCs driven into the osteogenic lineage revealed a continuous rise of impedance due to matrix deposition and strong cell-matrix contacts and furthermore by maturation and formation of a mineralized matrix. Adipogenic differentiation was marked by shallower initial slopes and eventually declining profiles, corresponding to more compact and roundish cells with lowered cell-cell contacts. Concordance of impedance profiles and differentiation markers of the varying differentiation potential of MSCs from different donor and age underlined the reliability of the system. MSC migration was delayed during adipogenesis or by increasing cell attachment in response to TNF alpha treatment. Pre-coating with ECM proteins revealed favored osteogenesis on collagen I and IV, whereas adipogenesis was increased on fibronectin, which was also reflected by impedance recordings. Overall, the present thesis revealed distinct differences of cell attachment during the process of differentiation and the guidance of differentiation by cell-matrix contacts and evaluated the potential of impedance measurements as a valuable tool for real-time, non-invasive high throughput screening of cell properties and identification of receptors involved in the regulation of differentiation processes.

Translation of abstract (German)

Aufgrund ihrer vielfältigen Funktionen sind mesenchymale Stammzellen (MSCs) interessant für die künstliche Gewebskonstruktion und die Zelltherapie. Obwohl die in vitro Differenzierung von MSCs gut etabliert und weitreichend untersucht wurde, ist wenig bekannt über die Stammzellnischen. Wie sind diese Nischen im Gewebe definiert und welche Matrix-Kontakte bestimmen das Schicksal der MSCs? Um dieser Frage nachzugehen wurde das Adhäsionsverhalten von MSCs unter verschiedensten Bedingungen mit Hilfe von Impedanz-Messungen untersucht. Fibroblasten und Keratinozyten dienten als unspezifische Kontrollen. Das Hauptaugenmerk lag auf den Veränderungen der Zelladhäsion und Migration während der Differenzierung in Fett- oder Knochen-Zelllinien, den Effekten von extrazellulären Matrix (EZM)-Kontakten auf diese Veränderungen und der Korrelation der Impedanz-Profile mit spezifischen Differenzierungsmarkern, bzw. wie diese Profile der Abschätzung der Differenzierung dienen können. Desweiteren wurden Zellen aus Knochen- und Fettgewebe verglichen um den Einfluss der Zellherkunft zu untersuchen. Während sich Keratinozyten klar unterschieden, stimmte die Adhäsion von MSCs im Wesentlichen mit dem Verhalten von Fibroblasten überein, was sich auch in Impedanz-Messungen widerspiegelte. Nach Induktion wiesen die Profile der osteogenen Differenzierung aufgrund von Reifung und Bildung einer mineralisierten Matrix und starken Zell-Matrix-Kontakten einen kontinuierlichen Anstieg der Impedanz auf. Adipogenese zeichnete sich durch anfänglich schwächere Steigung und später abfallende Profile aus. Dies deckte sich mit kompakteren und runden Zellen sowie geringeren Zell-Zell-Kontakten. Übereinstimmende Impedanzprofile mit dem Differenzierungsgrad der Zellen aus unterschiedlichen Spendern und unterschiedlichem Alter bestätigen diesen Ansatz. Migration von MSCs konnte durch Induktion der Adipogenese oder durch Verstärkung der Zellanheftung durch TNF -Behandlung verzögert werden. Zellinteraktionen mit EZM-Proteinen zeigten, dass die Osteogenese auf Kollagen I und IV bevorzugt wird, wohingegen die Adipogenese auf Fibronektin erhöht war. Diese Ergebnisse konnten durch Impedanzmessungen bestätigt werden. Die vorliegende Arbeit zeigt wesentliche Unterschiede der Zellanheftung während des Verlaufs und die Steuerung der Differenzierung durch Zell-Matrix-Kontakte auf und untersuchte die Möglichkeiten von Impedanz zur nicht-invasiven Hochdurchsatzbestimmung von Zelleigenschaften in Echtzeit und zur Identifizierung von Rezeptoren die an der Regulierung der Abläufe der Differenzierung beteiligt sind.