German Title: Analyse der miRNA-vermittelten Regulation von AP-1 in nicht-tumorigenen und tumorigenen HPV18-positiven Zelllinien

Preview

PDF, English Download (4MB) | Terms of use

Abstract

The transcription factor AP-1 is built up by dimerization of Jun and Fos family members and regulates major biological events like proliferation, invasion and apoptosis. The dimeriza-tion pattern of AP-1 changes when HPV-positive cells undergo malignant progression. While in HPV-positive non-malignant cells (“444”) AP-1 is composed of c-Jun/Fra-1, their malignant counterparts (“CGL3”) mainly express c-Jun/c-Fos heterodimers. Since microRNAs (miRNA), a potent group of post-transcriptional regulators, are often deregulated during malignant trans-formation, the regulation of AP-1 by miRNAs during cancer progression was analyzed. For this purpose, Drosha and Dicer, the key processing proteins in miRNA biogenesis, were knocked down by siRNAs. Quantitative RT-PCRs and Western blots showed that Fra-1 was regulated by miRNAs in non-tumorigenic and tumorigenic hybrids, but not in parental tumorigenic HeLa cells. c-Jun is repressed by miRNAs only in 444 and HeLa cells, but not in CGL3 cells, which express only low amounts of c-Jun. Conversely, c-Fos is indirectly up-regulated by miRNAs in HeLa cells. As analyzed by electro-mobility-shift / super shift-assays, the observed changes in protein expressions also resulted into modulations of AP-1 dimer composition that were also confirmed by AP-1 responsive Luciferase assays (TRE-Luc). Furthermore, reporter constructs harboring the 3’UTRs of c-Jun and Fra-1 showed direct regula-tion by miRNAs throughout the full-length 3’UTRs suggesting multiple miRNA binding sites and / or multiple regulatory miRNAs. Using an “Illumina” miRNA expression array, differentially expressed miRNAs in the non-tumorigenic and tumorigenic cell hybrids were detected and matched with miRNAs that were predicted to regulate c-Jun according to a bioinformatics analysis with PicTar, TargetScan, miRBase and DIANA microT. The data pointed towards miR-495 as one regulatory miRNA targeting c-Jun. Preliminary luciferase assays with over-expressed miR-495 did not reveal an interaction with a reporter construct harboring c-Jun 3’UTR. Other potential candidates were not tested. These results show for the first time that c-Jun and Fra-1 are direct targets of miRNAs and that c-Fos is submitted to an indirect miRNA regulation, thereby expanding known miRNA-c-Fos regulatory circuits. Moreover, it is demonstrated that miRNAs can modulate AP-1 composition and transcriptional activity in cervical carcinoma cells with potential consequences on AP-1 target genes.

Translation of abstract (German)

Der Transkriptionsfaktorkomplex AP-1 entsteht durch Dimerisierung von Jun und Fos Proteinen und reguliert wichtige biologische Prozesse wie Proliferation, Invasion und Apoptose. Die AP-1 Zusammensetzung ändert sich während der malignen Transformation HPV-positiver Zellen. Während die AP-1 Dimere in HPV-positiven, nicht malignen Zellhybriden („444“) vor allem aus c-Jun/Fra-1 bestehen, exprimieren maligne Zellhybride („CGL3“) c-Jun/c-Fos Heterodimere. Da microRNAs (miRNA) eine bedeutende Rolle bei der post-transkriptionellen Regulation spielen und durch maligne Transformation oft dereguliert sind, wurde die Regulation von AP-1 durch miRNAs vor dem Hintergrund der Krebsentwicklung untersucht. Für diesen Zweck wurden Drosha und Dicer, Schlüsselenzyme in der miRNA Bioge-nese, durch siRNAs supprimiert. Die anschließende Analyse mittels quantitativer RT-PCR und Western blots zeigte, dass Fra-1 in den nicht-tumorigenen und tumorigenen Zellhybriden reguliert ist, nicht aber in den parentalen, tumorigenen HeLa Zellen. c-Jun wird in 444 und HeLa Zellen durch miRNAs kontrolliert, während in CGL3 Zellen, die nur geringe Mengen c-Jun exprimieren, eine solche Regulation nicht gefunden wurde. Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass c-Fos nur in HeLa Zellen indirekt durch miRNAs reguliert ist. Die Suppression der miRNAs führte zu stöchiometrischen Veränderungen von AP-1, was mittels „electro-mobility-shift/super shift-assays“ (EMSA) gezeigt werden konnte. Darüber hinaus wurde auch die transkriptionelle Aktivität von AP-1 moduliert, wie am Beispiel von AP-1 sensitiven Luciferase Experimenten (TRE-Luc) verdeutlicht wurde. Weiterhin zeigten Luciferase Experimente mit Reporterkonstrukten der 3’UTRs, dass c-Jun und Fra-1 direkt durch mehrere miRNA Binde-stellen und / oder mehrere miRNAs inhibiert werden. Um die verantwortlichen miRNAs zu identifizieren, wurde ein miRNA Expressionsprofil der nicht-tumorigenen und tumorigenen Zellhybride erstellt. Der Abgleich unterschiedlich exprimierter miRNAs mit miRNAs, für die eine regulatorische Funktion durch in-silico Analysen (PicTar, TargetScan, miRBase and DIANA microT) vermutet wird, deutete auf miR-495 als verantwortliche miRNA für c-Jun hin. Jedoch zeigten vorläufige Luciferase Experimenten mit überexprimierter miR-495 keine Interaktion mit den c-Jun Reporterkonstrukten. Andere potentielle miRNAs wurden nicht getestet. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass c-Jun und Fra-1 direkt durch miRNAs reguliert werden, und dass c-Fos einer indirekten miRNA Regulation unterliegt, was die bisherigen Kenntnisse über die miRNA-c-Fos Regulation erweitert. Des Weiteren zeigt diese Arbeit, dass miRNAs die Zusammensetzung und die transkriptionelle Aktivität von AP-1 in Gebärmutterhalskrebs Zelllinien mit möglichen Auswirkungen auf AP-1 Zielgene modulieren können.