German Title: Vordringen von Lichtblattmikroskopie in Größere Tiefen

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Abstract

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) has established itself as an irreplaceable imaging technique in developmental biology over the past two decades. With its emergence, the extended recording of in toto datasets of developing organisms across scales became possible. Remarkably, LSFM opened the door to new spatio-temporal domains in biology, offering cellular resolution on the one hand, and temporal resolution on the order of seconds on the other hand. As in any fluorescence microscopy technique, LSFM is also affected by image degradation at greater tissue depths. Thus far, this has been addressed by the suppression of scattered light, use of fluorophores emitting in the far red spectrum, multi-view detection and fusion, adaptive optics, as well as different illumination schemes. In this work, I investigate for the first time in vivo optical aberration reduction via refractive index matching in LSFM. Examples are shown on common model organisms as Arabidopsis thalina, Oryzias latipes, Mus musculus, as well as Drosophila. Additionally, I present a novel open-top light-sheet microscope, tailored for high-throughput imaging of mammalian samples, such as early stage mouse embryos. It is based on a three objective geometry, encompassing two opposing detection objective lenses with high light collection efficiency, and an invertedly mounted illumination lens. It bridges the spatial scale between samples by employing an extendible light-sheet illumination via a tunable acoustic gradient index lens. Both parts of this work improve the image quality across the 3D volume of specimens, paving the way for more quantitative recordings at greater tissue depths.

Translation of abstract (German)

Lichtblatt-Fluoreszenzmikrosopie (LSFM, vom Englischen) hat sich in den letzten beiden Jahrzehnten als essentielle Technik zur Bildgebung in der Entwicklungsbiologie etabliert. Mit ihrer Existenz sind ausgedehnte, sowie Skalen überbrückende in toto Aufnahmen von sich entwickelnden Organismen möglich geworden. Bemerkenswerterweise hat LSFM die Tür für eine neue raum-zeitliche Domäne in der Biologie geöffnet, indem sie einerseits zelluläre Auflösung, und andererseits zeitliche Auflösung im Sekundenbereich bietet. So wie jede Fluoreszenzmikroskopie-Technik, ist auch LSFM von einer Bildverschlechterung in größeren Gewebstiefen betroffen. Bisher wurde dies durch Unterdrücken von Streulicht, Verwendung von Fluorophoren, die im nahinfraroten Spektrum emittieren, Detektion von verschiedenen Seiten und anschließender Daten-Fusion, adaptiver Optik und verschiedenen Beleuchtungsstrategien adressiert. In dieser Arbeit, untersuche ich zum ersten Mal die in vivo Verringerung von optischen Aberrationen mittels Brechungsindex-Anpassung in LSFM. Es werden Beispiele an üblichen Modellorganismen wie Arabidopsis thaliana, Oryzias latipes, Mus musculus, sowie Drosophila melanogaster gezeigt. Zusätzlich präsentiere ich ein neuartiges, nach oben geöffnetes Lichtblatt-Mikroskop, das speziell für Hochdurchsatz-Aufnahmen von Säugetier-Proben, wie z.B. frühen Mausembryonen, zugeschnitten ist. Es basiert auf der Geometrie dreier zueinander angeordneter Objektive, bestehend aus zwei gegenüberliegenden Detektions-Objektiven mit einer hohen Lichtaufnahme-Effizienz, sowie einer invertiert montierten Beleuchtungslinse. Das Mikroskop überbrückt die räumliche Skala zwischen unterschiedlichen Proben, indem es eine ausdehnbare Lichtblatt-Beleuchtung mittels einer steuerbaren akustischen Gradientenindex-Linse verwendet. Beide Teile dieser Arbeit verbessern die Bildqualität in den aufgenommenen 3D Volumen der Proben, und ebnen damit den Weg zu quantitativeren Aufnahmen in größeren Gewebstiefen.