German Title: Herstellung chemisch modifizierter Substrate zur Analyse von Zellverhalten

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Abstract

Cell migration plays a major role in processes like wound healing, including lymphangiogenesis. It is especially influenced by the extracellular matrix. In this thesis chemical synthesis and material science are combined to address biological questions in a biological chemistry approach. This enables the analysis of the influence of different extracellular matrix modules on cell behaviour. On the one hand a concentration and density dependent effect of short hyaluronan is analysed. On the other hand a novel specific and unspecific binding model for the extracellular matrix is developed. Several chemical modification strategies are tested to immobilise hyaluronan on a surface. Therefore modifications at the reducing-end are introduced using cysteamine hydrochloride, propargylamine and dibenzocyclooctyne-amine and at the carboxy groups within the chain using again propargylamine. In case of the end-thiolated hyaluronan a degree of thiolation of 4.0 ± 0.5 % is achieved, and for the functionalisation within the chain a degree of alkynation of 16% is determined. All desired molecules could be synthesised and enable immobilisation of the hyaluronan species. After the chemical modification, the bioactivity is verified via the analysis of the interaction between the hyaluronan species and the hyaladherine aggrecan as well as LYVE-1. Especially the interaction between aggrecan and hyaluronan proves the conservation of the bioactivity during the modification. To determine the influence of short hyaluronan on lymphendothelial cells the AlamarBlue® and CyQuant® assay are established. A cell density of 131 mm-2, an incubation time of 2 h (AlamarBlue® assay) and 5min (CyQuant® assay) are determined. Compared are the influences of an enzymatically digested (10 kDa) and short hyaluronan (20 kDa) species which are applied to lymphendothelial cells in different concentrations and densities. To analyse the density related effect, the hyaluronan is immobilised on gold nanostructured surfaces. Between the two employed species no difference in cell behaviour is found. In the case of the application of hyaluronan in solution no difference in the relative metabolic activity is found. For the immobilised hyaluronan species a reduced ability to adhere to the surface is observed for the increasing nanoparticle density. Here, for both hyaluronan species a biphasic effect in relative metabolic activity is detected with maxima for a particle density of 540 μm-2. To investigate collective cell migration two novel photocleavable ligands are developed. Synthesised are an unspecific ligand 1-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl) ethyl 11-mercaptoundecanoate and the specific, caged antagonist of the integrin α5β1 1-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl)-ethyl (3(S))-3-(4-(3-(6-(3-mercaptopropanamido)- hexanamido)-propoxy)-benzamido)-4-(4-(3-((4-methoxypyridin-2-yl)-amino)-propoxy)phenyl)butanoate. 1-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl)ethyl 11-mercaptoundecanoate can be synthesised with a yield of 18%. In QCM-D experiments, the adsorption happens with a specific decay time of (1899.0 ± 776.3) min at 21 ◦C, while the cleavage after UV irradiation takes (2.52 ± 0.64) min at 21 ◦C. The absorption spectrum of the molecule shows a band at 345 nm, which is blue shifted to 322 nm upon irradiation with UV light. Also, an isobestic point can be observed at 370 nm. An analysis of the toxicity of 4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl ethanol shows an increasing metabolic activity of the used MDCK II cells for 4,5-dimethoxy- 2-nitrophenyl ethanol, but no effect for 1-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl)ethyl 11-mercaptoundecanoate is observed. In summary, well-controlled chemical variations of surfaces enable novel approaches to study biological systems. Here a method is demonstrated to immobilise HA on a surface which allows the evaluation of the influence of HA on the basal side of lymphendothelial cells. Furthermore a novel intergrin-specific photocleavable ligand is developed to study collecitve cell migration.

Translation of abstract (German)

Zellmigration ist ein wichtiger Prozess bei der Wundheilung und der Lymphangiogenese. Diese wird im Besonderen durch die extrazelluläre Matrix beeinflusst. In dieser Arbeit werden chemische Synthese und Materialentwicklung zu einem neuen Konzept der biologischen Chemie vereint, um biologische Fragestellungen zu untersuchen. Auf diese Weise ist es möglich, den Einfluss verschiedener Modelle für die extrazelluläre Matrix und ihren Einfluss auf das Zellverhalten zu analysieren. Auf der einen Seite wird ein konzentrations- und dichteabhängiger Effekt von kurzkettiger Hyaluronsäure untersucht. Auf der anderen Seite wird ein neuartiges Modell der extrazellularen Matrix für unspezifische und spezifische Zellinteraktion vorgestellt. Verschiedene Strategien zur chemischen Modifikation werden getestet, um die Immobilisierung von Hyaluronsäure auf Oberflächen zu ermöglichen. Dazu werden Modifikationen am reduzierenden Ende der Hyaluronsäure mittels Cysteaminhydrochlorid, Propargylamin und Dibenzocyclooctin-amin durchgeführt. Außerdem wird die Carboxygruppe in der Kette mit Propargylamin modifiziert. Im Fall der endständigen Thiolierung kann ein Thiolierungsgrad von (4.0 ± 0.5) % und im Fall der Alkinierung innerhalb des Moleküls ein Alkinierungsgrad von 16% erreicht werden. Alle angestrebten Modifikationen konnten erfolgreich durchgeführt werden und ermöglichen die Immobilisierung der Hyaluronsäurevarianten. Nach der chemischen Modifikation, die nötig ist, um die Hyaluronsäure zu immobilisieren, wird die biologische Aktivität der Spezien überprüft. Dazu wird die Interaktion der immobilisierten Hyaluronsäure mit dem Hyaladherin Aggrecan sowie dem Rezeptor LYVE-1 analysiert. Besonders die Interaktion zwischen Aggrecan und Hyaluronsäure zeigt, dass die Bioaktivität durch die chemische Modifikation nicht beeinträchtigt wird. Um den Einfluss kurzkettiger Hyaluronsäure auf Lymphendothelzellen zu untersuchen wird sowohl der AlamarBlue® als auch der CyQuant® Assay eingesetzt. Für die Verwendung der Assays wird eine optimale Zelldichte von 131 mm-2 und eine Inkubationszeit von 2 h für den AlamarBlue® und 5min für den CyQuant® Assay ermittelt. Anschließend wird der konzentrations- und dichteabhängige Einfluss einer enzymatisch verdauten (10 kDa) und einer kurzen (20 kDa) Hyaluronsäurespezies auf Lymphendothelzellen untersucht. Um den Einfluss der Dichte zu untersuchen, wird endthiolierte HA auf Gold-nanostrukturierten Oberflächen immobilisiert. Der Vergleich der beiden verschiedenen Spezies zeigt keine Veränderung im Zellverhalten. Im Fall der Inkubation der Zellen mit Hyaluronsäure in Lösung konnte ebenfalls kein Einfluss auf die metabolische Aktivität ermittelt werden. Für die immobilisierte Hyaluronsäure hingegen wird ein Rückgang in der Zelladhäsion mit zunehmender Nanopartikeldichte verzeichnet. Sowohl für die enzymatisch verdaute als auch die kurzkettige Hyaluronsäure wird ein biphasischer Effekt für die relative metabolische Aktivität festgestellt, mit einem Maximum bei einer Partikeldichte von 540 μm-2. Um kollektive Zellmigration zu untersuchen werden im zweiten Teil zwei neuartige photospaltbare Liganden vorgestellt. Zum einen ein Ligand für ein unspezifisches Bindungsmodell (1-(4,5-Dimethoxy-2-nitrophenyl)ethyl 11-mercaptoundecansäure) und zum anderen für ein selektives Bindungsmodell, der spezifische, maskierte Antagonist des Integrins α5β1 1-(4,5-Dimethoxy-2-nitrophenyl)- ethyl-(3(S))-3-(4-(3-(6-(3-mercaptopropanamido)-hexanamido)-propoxy)- benzamido)-4-(4-(3-((4-methoxypyridin-2-yl)-amino)-propoxy)-phenyl)- butansäure. 1-(4,5-Dimethoxy-2-nitrophenyl)ethyl 11-mercaptoundecansäure kann mit einer Ausbeute von 18% hergestellt werden. Mittels QCM-D wird die Adsorption und Spaltung des Liganden untersucht und eine spezifische Halbwertszeit von (1899.0 ± 776.3) min für die Adsorption und (2.52 ± 0.64) min für die Spaltung jeweils bei 21 ◦C ermittelt. Das Absorptionsspektrum des Liganden weist eine Bande bei 345 nm auf, die eine Blauverschiebung zu 322 nm aufgrund einer Bestrahlung mit UV-Licht aufweist. Außerdem zeigt das Spektrum einen isobestischen Punkt bei 370 nm. Die Analyse der Toxizität von 4,5- Dimethoxy-2-nitrophenylethanol und 1-(4,5-Dimethoxy-2-nitrophenyl)ethyl- 11-mercapto-undecansäure zeigt einen Anstieg der metabolischen Aktivität der genutzten MDCK II Zellen mit zunehmender Ligandenkonzentration für 4,5- Dimethoxy-2-nitrophenylethanol, jedoch keinen Effekt für die Thiolspezies. Kurzum, durch die kontrollierte chemische Veränderung von Oberflächen ist es möglich, neue Strategien zur Untersuchung biologischer Fragestellungen zu entwickeln. In dieser Arbeit werden chemische Methoden vorgestellt, um Hyaluronsäure zu immobilisieren und so deren Auswirkung auf Lymphendothelzellen zu untersuchen. Dabei erfolgt die Wechselwirkung von Zellen und Hyaluronsäure an der basalen Seite. Darüberhinaus wird ein neuer photospaltbar maskierter Ligand vorgestellt, der zur Untersuchung kollektiver Migration verwendet werden kann.