German Title: Die Jumonji-C-Domäne mit Proteinen PHF2 und PHF8 stimulieren die Transkription der rRNA-Gene

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Abstract

In mammalian cells, actively transcribed rRNA genes (rDNA) exist in a euchromatic configuration, whereas silent rDNA repeats form a heterochromatic structure. A hallmark of active rDNA is methylation of histone H3 lysine K4 (H3K4me), while silent genes are characterized by methylation of histone H3 lysine K9 (H3K9me). The balance between H3K4me and H3K9me is established and maintained by the coordinated interplay of different histone methyltransferases and demethylases. Several histone H3K9 methyltransferases such as G9a, SETDB1 and Suv39H1, have been shown to modulate the chromatin structure of rRNA genes. However, the enzymes that remove repressive methyl groups from H3K9 at the rDNA promoter are yet unknown. In the present study, the function of two putative Jumonji-C (JmjC) domain-containing histone demethylases PHF2 (PHD finger protein 2) and PHF8 (PHD finger protein 8) has been characterized. Both PHF2 and PHF8 localize to nucleoli and are associated with active rRNA genes. Gain-of-function and loss-of-function experiments demonstrate that PHF2 and PHF8 activate rDNA transcription. Transcriptional activation depends on the presence of a functional PHD finger and the JmjC domain. Recruitment of PHF2 and PHF8 to rDNA is mediated by the interaction with the RNA polymerase I (Pol I) transcription machinery. In addition, the PHD fingers of PHF2 and PHF8 bind to the euchromatic histone mark, H3K4me3, which may facilitate the association of both proteins with active rDNA. Depletion of PHF8 leads to increased levels of the repressive marks H3K9me1 and H3K9me2 (H3K9me1/2) at the rDNA promoter, suggesting that PHF8 demethylates H3K9me1/2. In contrast, PHF2 shows no histone demethylase activity on itself but appears to antagonize a transcriptional repressor, the H3K4me3 demethylase KDM2B. The association of PHF2 with rDNA depends on PHF8, indicating that PHF2 and PHF8 function as a complex that is able to remove H3K9me1/2 and to maintain H3K4me3 at active rDNA repeats. Mutations in the human PHF8 gene are associated with an inherited disease termed X-linked mental retardation (XLMR). As demonstrated in this study, an XLMR-associated point mutation in the JmjC domain of PHF8 (F279S) impairs the interaction with the Pol I transcription machinery, the nucleolar localization and PHF8-dependent transcriptional activation. Thus, impairment of PHF8-mediated activation of rDNA transcription might contribute to the development of XLMR. Together, the results uncover an important function of PHF2 and PHF8 in nucleoli, adding a new layer of epigenetic regulation of rRNA genes. This regulation is vital for proper rRNA synthesis and its disruption is likely to cause severe diseases in humans.

Translation of abstract (German)

Die Gene, die für rRNA kodieren (rDNA), liegen in Säugerzellen in mehreren hundert Kopien vor, von denen etwa die Hälfte transkriptionell aktiv, die andere Hälfte inaktiv ist. Aktive und inaktive rDNA Kopien weisen eine unterschiedliche Chromatinstruktur auf. Aktive Gene liegen in ‚offener’ euchromatischer Konfiguration vor, während inaktive Gene eine kompakte heterochromatische Struktur aufweisen. Nukleosomen an aktiven rDNA Promotoren sind durch spezifische Histonmodifikationen charakterisiert, die sich von Histonmodifikationen an inaktiven Genen unterscheiden. So ist z.B. Histon H3 am Promotor aktiver Gene an Lysin 4 methyliert (H3K4me), während Histon H3 an inaktiven Gene an Lysin 9 methyliert (H3K9me) ist. Das Gleichgewicht zwischen H3K4me und H3K9me wird durch das koordinierte Zusammenspiel von verschiedenen Histon-Methyltransferasen und -Demethylasen etabliert und aufrechterhalten. Für verschiedene Histon-H3K9-Methyltransferasen wie G9a, SETDB1 und Suv39H1 konnte gezeigt werden, dass sie die Chromatinstruktur von rDNA modulieren. Enzyme, die reprimierende Methylgruppen von H3K9 am rDNA Promotor entfernen, sind bislang unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wird die Funktion von zwei putativen Histon-Demethylasen, PHF2 und PHF8, charakterisiert. Sowohl PHF2 als auch PHF8 lokalisieren in Nukleoli und sind mit aktiven rRNA Genen assoziiert. Depletierungs- und Überexpressions-Experimente demonstrieren, dass PHF2 und PHF8 die Pol I Transkription aktivieren. Die transkriptionelle Aktivierung hängt von der Präsenz eines funktionellen PHD-Fingers und der JmjC-Domäne ab. PHF2 und PHF8 werden durch Interaktion mit der Pol I Transkriptionsmaschinerie an die rDNA rekrutiert. Zusätzlich binden die PHD-Finger von PHF2 und PHF8 an H3K4me3, ein Befund der die Bindung von PHF2 und PHF8 an aktive rRNA Gene unterstützt. Wird PHF8 durch siRNA depletiert, wird H3K9 am rDNA Promotor verstärkt methyliert. Dies weist darauf hin, dass PHF8 eine H3K9me1/2 Demethylase ist. Im Gegensatz dazu zeigt PHF2 keine Histon-demethylierende Aktivität, sondern scheint der H3K4 Demethylase KDM2B entgegenzuwirken. Mutationen in dem humanen PHF8 Gen korrelieren mit der Erbkrankheit XLMR (X-linked mental retardation). Eine mit XLMR-assoziierte Punktmutation in der JmjC-Domäne von PHF8 (F279S) verhindert sowohl die Interaktion mit der Pol I-Transkriptionsmaschinerie als auch die nukleoläre Lokalisation und die PHF8-vermittelte Aktivierung der prä-rRNA. Es ist daher sehr wahrscheinlich, dass Inaktivierung von PHF8 zur ineffizienten rDNA Transkription führt und dies zur Entstehung von XLMR beiträgt. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen eine wichtige Rolle von PHF2 und PHF8 in der epigenetischen Regulation von rRNA Genen. Diese Regulation ist essentiell für die effiziente Transkription von rRNA Genen, und deren Dysregulation führt zu schweren genetischen Krankheiten.