English Title: Neurogenesis in the Vertebrate Central Nervous System - Molecular Mechanisms Controlling the Region-specific Expression of neurogenin1 in the Embryo of the Zebrafish (Danio rerio)

Preview

PDF, German Download (23MB) | Terms of use

Abstract

Während der Embryonalentwicklung von Vertebraten kontrollieren drei hoch konservierte Enhancer die raumzeitliche Expression orthologer neurog1-Gene. In Anamniota wie dem Zebrafisch wird die Transkription des proneuralen Gens nach Bildung der Neuralplatte durch zwei dieser cis-regulatorischen Elemente gesteuert. Transgenanalysen zeigen, dass der distale LSE-Enhancer neurog1 im Telencephalon und der proximale LATE-Enhancer im Diencepha-lon der Gehirnanlage aktiviert (Blader et al., 2003). Pax6 aktiviert die diencephale neurog1-Expression durch direkte Interaktion mit LATE, und es wird vermutet, dass diese Interaktion zur Kooption von neurog1 im lateralen Telencephalon der Maus und damit zur Evolution des Neocortex in Amniota entscheidend beigetragen hat. Jedoch müssen andere mit Pax6 kooper-ierende Faktoren an diesem Prozess beteiligt sein, einerseits, weil neurog1 in anderen Regio-nen auch unabhängig von Pax6 exprimiert wird, andererseits, weil Pax6 allein zur neurog1-Aktivierung nicht ausreicht, etwa im Telencephalon des Zebrafischs (Blader et al., 2004). Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob und wie weitere Transkriptionsfaktoren (TFs) in die Regulation der regionsspezifischen neurog1-Expression im Diencephalon des Zebra-fischs durch Interaktion mit dem LATE-Enhancer involviert sind. Eine Kombination aus Sequenzanalyse, Mutationsanalyse mit Reportertransgenen und Koexpressionsanalyse poten-tieller TF-Kandidaten weist auf eine Beteiligung von Homeodomänen-TFs der POU-Klasse (POU-TFs) an der LATE-vermittelten Regulation von neurog1 hin: Bioinformatische Analysen identifizieren POU-Bindestellen im stromabwärts der Pax6-Bindestelle benachbarten und in Vertebraten vollkommen konservierten LATE-Fragment, die selektiv mit rekombinantem Pou50-Protein physisch interagieren. Deletion dieses Fragments im LATE-Reporter induziert ektopische Transgenaktivität spezifisch im Telencephalon, was beweist, dass die anzestrale LATE-Funktion nicht auf diencephale Aspekte der neurog1-Expression beschränkt ist. LATE kooperiert hierbei mit dem LSE-Enhancer. Eine eigens für die Koexpressionsanalyse entwickelte Methode zur virtuellen 3D-Visualisierung von Genaktivitäten konnte nachweisen, dass in der ektopischen Transgendomäne neurog1, Pax6 und POU-TFs koexprimiert sind. Überdies kann die ektopische Transgen- und endogene neurog1-Aktivität spezifisch im Telencephalon durch HDAC-Inhibition reproduziert bzw. verstärkt werden. Die präsentierten Daten zeigen eindeutig, dass LATE ein direktes Ziel nicht nur positiv, sondern auch negativ regulierender Signale darstellt, und weisen darauf hin, dass neben transkriptioneller Aktivierung durch Kooption auch die Aufhebung transkriptioneller Repression für die Evolution des Neocortex entscheidend war.

Translation of abstract (English)

During embryonic development of vertebrates three higly conserved enhancers control the spatiotemporal expression of orthologous neurog1 genes. After formation of the neural plate, in anamniota such as zebrafish, the transcription of the proneural gene is driven by two of these cis-regulatory elements. Transgenic analyses have shown that the distal LSE enhancer activates neurog1 in the telencephalon and the proximal LATE enhancer in the diencephalon of the brain anlage (Blader et al., 2003). Pax6 activates diencephalic neurog1 expression via direct interaction with LATE, and it is assumed that this interaction was crucial for the co-option of neurog1 in the lateral telencephalon of the mouse, and therefore for neocortex evolution in amniota. However, other factors cooperating with Pax6 must be engaged in this process, as on the one hand, other regions express neurog1 independently of Pax6, and on the other hand, Pax6 is not sufficient for the activation of neurog1, as in case of the zebrafish telencephalon (Blader et al., 2004). The scope of the present study was to investigate whether and how other transcription factors (TFs) are involved in the regulation of region-specific neurog1 expression in the dience-phalon of the zebrafish embryo through interaction with the LATE enhancer. A combined experimental approach consisting of sequence analysis, mutational analysis of reporter trans-genes together with co-expression analysis of potential TF candidates points to an involve-ment of POU-specific homeodomain TFs (POU-TFs) for the LATE-mediated regulation of neurog1: Bioinformatic analyses identify POU binding sites inside a LATE fragment flanking the upstream Pax6 binding site that is fully conserved between vertebrates and that is able to physically interact selectively with recombinant Pou50 protein. Deletion of this fragment induces ectopic LATE reporter activity specifically in the telencephalon providing evidence for an ancestral function of LATE not to be limited to diencephalic aspects of neurog1 expression. At the same time, LATE cooperates with the LSE enhancer. The ectopic transgene domain co-expresses neurog1, Pax6, and POU-TFs, as shown by results obtained from a method especially developped here for computer-aided 3D visualisation of gene expression. Moreover, this ectopic transgene and endogenous neurog1 activity in the telen-cephalon is reproduced and reinforced by HDAC inhibition, respectively. The presented data unambigously indicate that LATE is not only a target of positively but also negatively acting positional cues, suggesting that besides trancriptional activation by co-option also breakup of transcriptional repression was critical for neocortex evolution.