German Title: Interaktion der menschlichen Papillomavirus 20 und 4-nitroquinoline-1-oxid in Carcinogenese

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Abstract

Human papillomaviruses (HPV) infect mucosal and cutaneous tissue. They induce several epithelial lesions ranging from benign warts to cancer. HPV infection has been demonstrated to play a role in the pathogenesis of cervical, vulvar, penile, anal, skin, head and neck cancers. HPV infection is associated with benign and malignant lesions in the hereditary skin disease Epidermodysplasia verruciformis (EV), characterized by cutaneous lesions that progress to squamous cell carcinoma after UV exposure. Head and neck tumor (HNSCC) patients have been classified into two epidemiological entities, corresponding to either alcohol/tobacco use or HPV infection. High risk mucosal HPV is involved in the pathogenesis of a subset of HNSCC, particularly those that arise from the lingual and palatine tonsils within the oropharynx. Although low risk HPV have been found in several cancers, their gene products do not induce immortalization per se, and they probably need other co-factors to modify cellular genes and contribute to tumorigenesis. Cutaneous HPV20 has been found in a number of non melanoma skin cancers as well as in esophageal carcinoma and in HNSCC patients. HPV20 infection combined with UV exposure promotes malignant progression in skin as demonstrated in HPV20 E6/E7 transgenic mice in the presence of chronic UV irradiation. These animals presented papilloma formation that lead to transformation. However, involvement of HPV20 in esophageal cancer and HNSCC have to date not been elucidated. In this study, the cooperation between HPV20 infection and a chemical carcinogen in the pathogenesis of oropharynx and esophageal cancer was investigated. The synthetic carcinogen 4-NQO is a UV-mimetic that shares the same mechanistic action with the carcinogenic compounds present in tobacco. In order to examine its involvement (comparable with the effect of tobacco) in increasing the viral oncogenic potential, 4-NQO was applied either to cells or organotypic cultures and combined with HPV20 by following two approaches: Promoter activation assays demonstrated that HPV20 E6 and/or E7 up-regulated its own viral promoter and this effect was further enhanced by 4-NQO treatment. These changes in the viral promoter activity may indicate a positive cooperation between the virus and the chemical in the onset of disease. Secondly, alterations in proliferation, differentiation, apoptosis and skin barrier functionality were studied in organotypic cultures expressing HPV20 E6 and treated with 4-NQO. Although these cultures were able to stratify and differentiate they failed to form a normal epidermis. Moreover, the normal differentiation markers pattern was disturbed, resembling simpler epithelia and this phenotype was enhanced after 4-NQO treatment. Cellular protein p53 accumulated whereas p21CIP1 and ΔNp63α modifed their expression pattern in the epithelia. Organotypic raft cultures expressing HPV20 E6 gene presented foamy-like keratinocytes resembling the typical structures found in Epidermodysplasia verruciformis patients and pityriasis versicolor -like lesions infected with HPV20. In addition, HPV20 E6 expression was capable of altering the functionality of the skin barrier function by abrogation of tight junction formation in the stratum granulosum and by changes in the lipid metabolism of the skin leading to its accumulation and deregulated composition. Disruption of the skin barrier has been observed in a number of cutaneous diseases as ichthyosis, atopic dermatitis and other eczemas. These studies provide insight into the functionality of HPV20 E6 in the epidermis. Moreover, the up-regulation in viral promoter activity and alterations in differentiation pattern under the context of HPV20 E6 expression and 4-NQO treatment compared with pLXSN and HPV16 E6/E7 controls showed the cooperation between HPV20 and chemical carcinogens. However, epithelial transformation was not observed and longer 4-NQO treatment would be necessary to analyze its influence in malignancy. Taken together, the conclusions obtained in the present work will be helpful in future experiments to elucidate the role of HPV20 infection and chemical carcinogens in the pathogenesis of esophageal and oropharyngeal tumors.

Translation of abstract (German)

Humane Papillomaviren (HPV) infizieren das Plattenepithel der Haut und der Schleimhäute. Die daraus folgenden Läsionen des Epithels sind Ursache für die Bildung von gutartigen Warzen bis hin zu Tumoren. HPV-Infektion spielt nachgewiesenermaßen eine Rolle in der Pathogenese von Gebärmutterhals-, Vulva-, Penis-, Anal-, Haut-, Kopf- und Halstumoren. HPV-Infektionen stehen im Zusammenhang mit gut - und bösartigen Hautveränderungen bei der Erberkrankung der Haut Hauterkrankung Epidermodysplasia verruciformis (EV). Diese ist charakterisiert durch Hautläsionen, die sich nach UV – Bestrahlung zum Plattenepithelkarzinom weiterentwickeln. Patienten mit Kopf- und Hals-Tumoren (HNSCC) wurden in zwei epidemiologische Einheiten unterteilt. Die eine bestand aus Patienten mit gesundheitlichen Schäden nach Alkohol- bzw. Tabakverbrauch, die andere aus Patienten mit HPV-Infektion. Infektionen mit „High-risk“ HPV der Schleimhäute hängen mit der Pathogenese bei einem Teil der HNSCC zusammen, insbesondere derjenigen, die aus der Tonsilla lingualis und Tonsilla palatina innerhalb des Oropharynx hervorgehen. Obwohl die „low-risk“ HPV Typen in mehrere Krebsarten vorhanden sind, verursachen ihre Genprodukte per se keine Immortalization. Womöglich benötigen sie weitere Faktoren um zelluläre Gene zu verändern und somit die Tumorentstehung zu verursachen. Der Kutaner HPV20 Typ wurde in einer Reihe von Nicht-melanomatösen Hautkrebs- (NMSC), sowie in Ösophagus-Karzinom- und in HNSCC-Patienten nachgewiesen. Eine HPV20-Infektion in Kombination mit UV-Bestrahlung führt zu malignen Hautveränderungen. Dies wurde in HPV20 E6/E7 transgenen Mäusen, die chronischer UV-Bestrahlung ausgesetzt waren, nachgewiesen. Diese Tiere zeigten ein höheres Proliferationsverhalten und eine Tendenz zur malignen Entartung durch eine größere Anzahl an Papillomen. Die Rolle der HPV20 bei Ösophagus-Karzinom und HNSCC ist bisher nicht geklärt. In der vorliegenden Studie wurde die Wechselwirkung zwischen einer HPV20-Infektion und einem chemischen Karzinogen in der Pathogenese des Oropharynx- und Ösophagus-Karzinoms untersucht. Das synthetische Karzinogen 4-NQO ist ein UV-Mimetikum, dass die gleichen Pathomechanismen hat wie die karzinogenen Tabakbestandteile. Um den Einfluss auf das virale-onkogene Potenzials zu untersuchen, wurde 4-NQO (ähnlich wie der Tabak) an Zellen bzw. organotypische Kulturen zugesetzt und mit HPV20 infiziert. Folgende zwei Forschungsansätze lagen zugrunde: Promotor activation assays zeigten, dass HPV20 E6 und / oder E7 seinen eigenen Virus-Promotor hochregulierte und dass dieser Effekt durch die 4-NQO-Behandlung noch zusätzlich verstärkt wurde. Die genannten Veränderungen in der Aktivität des viralen Promotors könnten auf eine positive Wechselwirkung zwischen dem Virus und der Chemikalie hindeuten, und dadurch eine Rolle in der Pathogenese von Krankheiten spielen. Die Änderungen in der Proliferation, Differenzierung, Apoptose und der Hautbarrierefunktion wurden in organotypischen Kulturen untersucht, wobei die HPV20 E6-Expression betrachtet und mit 4-NQO behandelt wurde. Diese Kulturen konnten Zellschichten bilden und eine Differenzierung konnte zwar stattfinden, doch war die Bildung einer normalen Epidermis nicht möglich. Der normale Differenzierungsmarker war beeinträchtigt und ähnelte einem einfachen Epithel, wobei dieser Phänotyp nach der 4-NQO-Behandlung verstärkt wurde. Es wurde eine Anhäufung des Zellproteins p53 beobachtet, während p21CIP1 und ΔNp63α ihre Epithel-Expressionsmuster veränderten. Organotypische Kulturen, die das HPV20 E6 Gen beinhalteten, bildeten schaumig aussehende Keratinozyten. Diese stellen die typischen Strukturen dar, die in Epidermodysplasia verruciformis Patienten und Pityriasis versicolor-aussehenden, HPV 20 infizierten, Läsionen gefunden wurden. Darüber hinaus konnte eine Veränderung der Hautbarrierefunktion durch die HPV20 E6 Expression gezeigt werden. Dies geschah durch eine Unterbrechung der Tight Junctions Bildung im Stratum granulosum und einen Einfluss des Stoffwechsels der Hautlipide, was zu ihrer Anhäufung und unregelmäßigen Zusammensetzung führte. Hautbarrierestörungen wurden bei zahlreichen Hauterkrankungen beobachtet, darunter Ichthyosis, atopische Dermatitis und anderen Ekzemen. Diese Studien zeigen die Wirkung und Funktion des HPV20 E6 auf die Epidermis. Ferner zeigten die Aktivierung des viralen Promotors und die Änderungen des Differenzierungsmarkers im Rahmen der Expression von HPV20 E6 und der 4-NQO-Behandlung im Vergleich zu den pLXSN- und HPV16-E6/E7-Kontrollen die Wechselwirkungen zwischen HPV20 und den chemischen Karzinogenen. Eine Transformation des Epithels wurde jedoch nicht erreicht. Für die Analyse ihrer Wirkung auf eine maligne Entartung ist eine längere 4-NQO-Behandlung vonnöten. Die oben erläuterten Beobachtungen können als Grundlage für weiterführende Untersuchungen und Experimente über die Rolle der HPV20-Infektion und der chemischen Karzinogene in der Pathogenese der Ösophagus- und Oropharynx-Tumore dienen.