German Title: Charakterisierung einer Maus-Modell ohne Acetylcholin-Rezeptor-Aktivität während der embryonalen Entwicklung

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Abstract

During embryonic development, acetylcholine (ACh) and the acetylcholine receptor (AChR) play a pivotal role in the establishment, maturation and maintenance of the neuromuscular junction (NMJ). In humans, genetic mutations affecting AChR-mediated signal transduction give rise to a variety of phenotypes mainly defined by muscle weakness, and known as congenital myasthenic syndromes (CMS), demonstrating the importance of AChR for the correct development of nerve/muscle contacts. However, thus far it has been impossible to determine the specific role played by AChR-mediated postsynaptic activity in NMJs during embryonic development. In this work, the effects caused by lack of postsynaptic activity in the NMJ were studied on a reporter mouse line generated by homologous recombination and expressing a structurally intact but functionally silent GFP-tagged AChR. In these animals, the  subunit of the AChR, normally expressed during embryonic development, carries a point mutation (P121L) which causes fast-channel CMS in human patients. Homozygous -fc animals die at birth, and a wide variety of severe physiological abnormalities appears during embryonic development, caused by the silencing of AChR-mediated postsynaptic potentials. The size, shape and density of the NMJ were profoundly altered by lack of postsynaptic activity, although the overall number of receptors did not seem to change. A vastly increased outgrowth of motor axons could also be detected, and this alteration is associated with the absence of motoneuron death at late embryonic stages. Further alterations could be found in the disorganization of muscle fiber architecture, and the presence of multiple innervation sites on single muscle fibers. These results clarify the role of AChR-mediated postsynaptic activity in the proper development and maturation of nerve/muscle contacts, and support the possibility that presynaptic development is influenced by putative reciprocal signaling between nerve and muscle. The reporter mice provide a new tool to distinguish in an as-yet unknown resolution between activity-dependent and putative structurally-dependent pathways during NMJ maturation, leading to important implications in the study of synapse formation and maintenance, as well as in the field of receptor studies.

Translation of abstract (German)

Während der Embryonalentwicklung, spielen Acetylcholin (ACh) und der Acetylcholinrezeptor (AChR) eine entscheidende Rolle bei der Etablierung, Entwicklung und Stabilisierung der neuromuskulären Synapse (NMJ). Genetische Mutationen, die die AChR-vermittelte Signaltransduktion beeinträchtigen, verursachen in Menschen Krankheiten, die vor allem durch Muskelschwäche definiert, und als Congenitale Myasthenische Syndrome (CMS) bekannt sind. Dies demonstriert wie wichtig der AChR für die korrekte Entwicklung der Nerv/Muskel-Kontakte ist. Allerdings war es bislang unmöglich, die spezifische Rolle der AChR-vermittelten postsynaptischen Aktivität in NMJ während der Embryonalentwicklung zu bestimmen. In dieser Arbeit wurde untersucht, wie sich das Fehlen von postsynaptischen Aktivitäten in NMJ auswirkt. Dazu wurde mittels homologer Rekombination eine Reportermauslinie generiert, die strukturell intakte aber funktionell stumme mit GFP-markierte AChR exprimierte. In diesen Tieren trägt die  Untereinheit des AChR, die normalerweise während der Embryonalentwicklung exprimiert wird, eine Punktmutation (P121L), welche „fast-channel“ CMS in Humanpatienten verursacht. Homozygote -fc Tiere sterben bei der Geburt. Die Analyse zeigt schwerwiegenden, physiologischen Abnormalitäten während der Embryonalentwicklung. Die Größe, Form und AChR Dichte der NMJ wird durch der Mangel an synaptischer Aktivität tiefgreifend verändert, obwohl die Gesamtzahl der Rezeptoren scheinbar unverändert ist. Außerdem ist das Wachstum des motorischen Axons stark erhöht und das entwicklungsabhängige Sterben von Motorneuronen finden nicht statt. Weitere Veränderungen können hinsichtlich der Desorganisation von Muskelfaserarchitektur und der Anwesenheit von multiplen Innervierungsstellen an einzelnen Muskelfasern festgestellt werden. Diese Ergebnisse verdeutlichen die zentrale Rolle von AChR-vermittelter postsynaptischer Aktivität für die korrekte Entwicklung und Reifung der Nerv/Muskel-Kontakte, und deuten darauf hin, dass präsynaptische Entwicklung durch ein putatives reziprokes Signal zwischen Nerv und Muskel beeinflusst wird. Die Reportermäuse stellen ein neues Werkzeug dar, um in bisher unerreichter Auflösung zwischen „aktivitätsabhängigen“ und bzw. „strukturabhängigen“ Signalen während der Entwicklung der NMJ zu unterscheiden. Sie tragen entscheidend zur Erforschung der Bildung und Stabilisierung von Synapsen und der regulatorischen Funktion der Neurotransmitterrezeptoren bei.