English Title: Characterization of CD4+CD25+Foxp3+ Regulatory T cells in the Ret Transgenig Mouse Model of Spontaneous Melanoma and in Melanoma Patients

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Abstract

CD4+CD25+Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Treg) sind essentiell für die Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz und das Vermeiden von Autoimmunerkrankungen. Sie entwickeln sich aus hämatopoetischen Vorläuferzellen im Thymus und stellen 5-10% aller CD4+ T-Zellen im peripheren Blut gesunder Individuen. Charakteristisch für Treg ist die Expression verschiedener Oberflächenmoleküle, darunter CD4, die -Kette des Interleukin-2-Rezeptors (IL-2R/CD25), das zytotoxische Lymphozyten-Antigen 4 (CTLA-4), der „glucocorticoid-induced TNF receptor“ (GITR) und der Transkriptionsfakor Foxp3. Treg sind in der Lage, Immunantworten von Effektor-T-Zellen gegen Tumore zu inhibieren. Diese Eigenschaft führte zur extensiven Erforschung der dieser inhibitorischen Funktion zugrunde liegenden Mechanismen. In der vorliegenden Arbeit wurde im ret transgenen Spontanmelanom-Mausmodelles die Verteilung natürlich vorkommender Treg in den lymphatischen Organen und den Primärtumoren der Mäuse, die humanen Melanomen hinsichtlich der Expression von Melanom assoziierten Antigenen (MAA), ihrer Immunogenität und Entwicklung ähnlich sind, charakterisiert. Mit Hilfe durchflusszytometrischer Untersuchungen wurde ein signifikanter Anstieg der Treg-Population in Tumoren in frühen im Vergleich zu späteren Krankheits- stadien festgestellt. Diese Veränderung korrelierte mit Beobachtungen im Knochenmark derselben Tiere, wo sich der Anteil der Treg an der CD4+ T-Zellpopulation im Verlauf der Krankheit erhöhte. Diese Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass Treg aus dem Knochenmark in den Tumor migrieren und dieses als Reservoir für Treg dient. In einem in vitro Proliferationsassay mit autologen CD4+ Effektor-T-Zellen wurde gezeigt, dass Treg von tumortragenden Tieren dasselbe inhibitorische Potenzial besaßen, wie Treg von C57BL/6 Wildtyp-Mäusen oder Ret transgenen tumorfreien Tieren, was eine Funktion der Treg bei der Tumorentstehung in diesem Mausmodell nahelegte. Die Depletion der Treg durch Administration des anti-CD25-Antikörpers pc61 beeinflusste jedoch weder die Geschwindigkeit der Tumorentstehung noch den Krankheitsverlauf oder den Allgemeinzustand der behandelten Tiere im Vergleich zu einer Kontrollgruppe. Zudem wurde gezeigt, dass durch die Gabe von pc61 i.p. zwar eine totale Depletion des CD25+ T-Zellkompartiments im Blut und in den lymphatischen Organen, nicht jedoch im Tumor erreicht werden konnte. Um einen Überblick über die Verteilung von Treg im peripheren Blut von Melanompatienten zu bekommen, wurden periphere Blutlymphozyten von Patienten, die entweder mit autologen, peptidbeladenen dendritischen Zellen (DC) vakziniert, oder systemisch mit Interferon- (IFN-)  behandelt worden waren, aus dem Zeitraum vor und nach Therapie hinsichtlich der Treg-Anzahl durchflusszytometrisch untersucht. Bei den männlichen Patienten beider Therapiegruppen zeigte sich nach Therapie mit dendritischen Zellen und IFN- eine tendenzielle Zunahme der Treg im peripheren Blut, im Vergleich zu einer Gruppe gesunder Spender im gleichen Alter aber keine signifikante Veränderung. Bei den weiblichen Patienten sank der Anteil der Treg an der CD4+ T-Zellpopulation nach Behandlung mit DC etwas ab, blieb jedoch vergleichbar mit einer Gruppe gesunder Altersgenossinen. Bei der Untersuchung einiger ausgewählter Patienten hinsichtlich des Vorkommens tumorantigenspezifischer Treg und CD4+ T-Zellen wurde zudem festgestellt, dass die Vakzinierung mit DC im Gegensatz zur Therapie mit IFN- die Anzahl spezifischer Treg und CD4+ T-Zellen im peripheren Blut zur Folge hat. Diese Daten zeigen, dass beim malignen Melanom innerhalb der Tumorprogression Veränderungen innerhalb der Treg-Population auftreten, die bei Tumorentwicklung eine Rolle spielen könnten.

Translation of abstract (English)

CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells play a cruical role in the maintenance of self-tolerance as well as in the prevention of autoimmune diseases. They develop from hematopoietic precursor cells in the thymus and reconstitute 5-10% of the peripheral CD4+ T cell subset in healthy individuals. Treg are characterized by the constitutive expression of several surface markers such as the cytotoxic T lymphocyte antigen 4, the glucocoird-induced protein of the TNF receptor family, the Interleukin-2 receptor-alphachain (CD25) and CD4. However, none of these markers is exclusively expressed on Treg but also on activated CD4+ effector T cells. During the last decade, a transcription factor of the forkhead/winged helix family, Foxp3, has been shown to play an essential role in the development and function of naturally occurring Treg. Treg can suppress CD4+ or CD8+ T cell mediated immune responses against tumors. This feature of Treg led to the extensive examination of the molecular mechanisms of the inhibitory function and the development of several immunotherapeutic strategies for the treatment of various cancers. However, none of these immunotherapeutic approaches resulted so far in significant clinical effects. Malignant melanoma is a rapidly progressing tumor, which is characterized by its poor response to conventional therapies like radiation and chemotherapy. In addition, it is highly immunogenic. Therefore, the development of immunotherapeutic strategies for the treatment of malignant melanoma is of particular interest. In the present work, the distribution of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in lymphatic organs and tumor tissue has been characterized using a ret transgenic mouse model of spontaneous melanoma. This model resembles the situation in human melanoma with respect to the tumor development, immunogeneicity and the expression of melanoma associated antigens. Tumors in early stages of development showed significantly increased levels of infiltrating Treg compared to tumors in later stages. This change inversely correlated with the situation in the bone marrow of the same mice, suggesting that Treg could migrate from the bone marrow into the tumor site. The inhibitory capacity of Treg from ret transgenic tumor bearing mice was examined in an in vitro proliferation assay with autologous conventional CD4+ T cells as responders in comparison to Treg from ret transgenic tumor free mice or non-transgenic littermates. It was shown, that the inhibitory function of Treg from ret transgenic tumor bearing mice was not altered. However, the depletion of CD25+ cells with anti-CD25 antibodies did not significantly influence the tumor development in the treated mice. We found that administration of these antibodies intraperitoneally led to total depletion of CD25+ cells in the blood and lymphoid organs, but not in the tumor site. This finding can partly explain a weak anti-tumor effect of anti-CD25 antibodies. Next, we studied, whether changes in Treg numbers could also be observed in the peripheral blood of melanoma patients, who received either vaccination with autologous dendritic cells (DC) pulsed with melanoma specific peptides or systemic therapy with InterferonIFN)-alpha. In male patients of both groups, Treg numbers slightly increased after the therapy. No significant changes were observed compared to an age matched group of healthy individuals. In female patients, Treg numbers in peripheral blood remained constant before and after the therapy with DC, as well as with IFN-alpha. Women, who were treated with IFN-alpha showed significantly lower numbers of Treg as compared to an age matched group of healthy individuals. Individual patients expressing HLA-DQ6 were also examined for the incidence of MelanA specific Treg in the peripheral blood before and after therapy. With HLA-DQ6/MelanA (25-36) tetramers, we observed that therapy with autologous DC, in contrast to IFN-alpha, led to the decrease in numbers of Treg and CD4+ T cells in the peripheral blood of these melanoma patients. Taken together, our data provide evidence of Treg alterations in melanoma progression in the ret transgenic mouse model and in melanoma patients and suggest a role of Treg in melanoma progression.