English Title: Characterisation of the sorting pathway of Ist2 in Saccharomyces cerevisiae

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Abstract

Ist2 ist ein integrales Membranprotein in S. cerevisiae. Die IST2-mRNA wird mit Hilfe der She-Proteine zum kortikalen ER an der Tochterzellspitze transportiert. Ist2-Protein wird unabhängig vom klassischen sekretorischen Weg zu Domänen der Plasmamembran transportiert, die zugänglich für externe Proteasen sind. Für den Transport an die Zellperipherie ist die Sequenz der C-terminalen 69 Aminosäuren von Ist2 erforderlich. In dieser Sequenz befindet sich auch das She2-bindende mRNA-Lokalisationssignal. Vermutlich erfolgt ein direkter Transport von Ist2 vom kortikalen ER zu Domänen der Plasmamembran. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Kopplung von Sec-unabhängigem Transport und lokaler Translation von Ist2 stattfindet. Außerdem sollten die Transportsignale im C-Terminus von Ist2 analysiert werden. Ein weiterer Gegenstand dieser Arbeit war die Identifikation von Interaktionspartnern von Ist2, die am Transport beteiligt sind. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die lokale Translation der IST2-mRNA keine Voraussetzung für den Sec-unabhängigen Transport von Ist2 darstellt. Da Ist2 für einen Zeitraum von wenigen Minuten zusätzlich am perinukleären ER akkumulierte, ist es wahrscheinlich, dass ein Teil der IST2-mRNAs am perinukleären ER translatiert wird. Für den Transport von Ist2 vom perinukleären ER zum kortikalen ER ist ein C-terminales Proteinmotiv aus basischen und hydrophoben Aminosäuren essentiell. Ferner ist die Ausbildung einer amphipathischen alpha-Helix für den Transport von Ist2 zur Zellperipherie notwendig. Die amphipathische Helix besteht aus den C-terminalen elf Aminosäuren und enthält auf einer Seite einen schmalen Winkel aus hydrophoben Leucinen. Die Leucine konnten nur durch sehr hydrophobe und sperrige Aminosäuren ersetzt werden, ohne den Transport von Ist2 zu beeinträchtigen. Mutation der Leucine bzw. ein Verlust der amphipathischen Anordnung oder der helikalen Struktur führten zu punktförmigen Akkumulationen von mutiertem Ist2 in spezifischen Domänen des perinukleären, kortikalen und tubulären ERs. Bei der Analyse von Interaktionspartnern von Ist2, die am Transport beteiligt sein könnten, wurden die Membranproteine Sac1 und Scs2 identifiziert. Sac1 reguliert die Phosphatidylinositolphosphat-Level der jeweiligen Kompartimente und definiert dadurch deren Membranidentität. Durch ein Zusammenspiel von Sac1 und dem Adaptor Scs2 könnte an ER-Plasmamembran-Kontaktstellen eine Anreicherung von Ist2 stattfinden und eine Membranumgebung geschaffen werden, die einen Transport von Ist2 vom kortikalen ER zu Domänen der Plasmamembran bewirkt. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein Sortierungssignal identifiziert werden, das die Anreicherung des integralen Membranproteins Ist2 am kortikalen ER bewirkt. Es ist möglich, dass vom kortikalen ER ein weiterführender Transport zu Domänen der Plasmamembran stattfindet.

Translation of abstract (English)

Ist2 is an integral membrane protein in S. cerevisiae. The IST2-mRNA is transported to the cortical ER at the bud tip via the She-machinery. Ist2 localises to domains of the plasma membrane which are accessible to external proteases. Trafficking of Ist2 occurs independently of the classical secretory pathway. The sequence encoding the C-terminal 69 amino acids of Ist2 is essential for transport to the cell periphery. This sequence also comprises the mRNA-localisation signal which is recognised by the She2-protein. Presumably a direct transport of Ist2 from the cortical ER to domains of the plasma membrane takes place. The aim of this study was to analyse if the Sec-independent transport of Ist2 is coupled to local translation of the IST2-mRNA. In addition, transport signals located in the C-terminus of Ist2 should be determined. Finally, transport factors, which are necessary for Sec-independent sorting of Ist2 should be identified. It could be shown that local translation of the IST2-mRNA is no prerequisite for Sec-independent trafficking of Ist2. As Ist2 additionally accumulated at the perinuclear ER for a time-frame of a few minutes, some IST2-mRNAs are probably translated at the perinuclear ER. A protein motif consisting of several basic and hydrophobic amino acids, located at the Ist2-C-terminus, is necessary and essential for transport of Ist2 from perinuclear to cortical ER. Furthermore the assembly of an amphipathic helix, comprising the C-terminal eleven residues, is needed for transport of Ist2 to the cell periphery. A narrow region of hydrophobic leucines is located on one side of the amphipathic helix. For correct transport of Ist2 to the cell periphery, the leucines could only be replaced by very hydrophobic and bulky residues. Mutation of the leucines and loss of the amphipathic arrangement or the helical structure resulted in dotlike accumulation of mutated Ist2 in specific domains of perinuclear, tubular and cortical ER. Regarding interacting factors, which might be involved in trafficking of Ist2, the membrane proteins Sac1 and Scs2 were identified. The lipid phosphatase Sac1 is a regulator of phosphoinositide levels and thereby determines the membrane identity of organells. In a concerted action of Sac1 and the adaptor Scs2 an accumulation of Ist2 might occur at plasma membrane-ER-contact sites. This accumulation could create a membrane environment which is capable of transport of Ist2 from cortical ER to domains of the plasma membrane. In summary, a sorting signal could be identified which mediates accumulation of the integral membrane protein Ist2 at the cortical ER. It is possible that further transport from cortical ER to domains of the plasma membrane takes place.