German Title: Induktion und Regulation von Plasmamembran "Blebbing" durch SH4-Domänen und dem Diaphanous Related Formin FHOD1

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Abstract

Die Plasmamembran (PM) tierischer Zellen besteht aus einer dynamischen, lipidhaltigen Doppelschicht, die beispielsweise bei der Bildung von Zellausläufern wie Lamellipodien, Filopodien oder Membranfalten abhängig von zellulären Bedürfnissen konstant umgestaltet wird. Die ballonartigen PM "blebs" stellen ebenfalls einen solchen Typ Zellausläufer dar und können zum Beispiel während Apoptose, Sekretion und Zellbeweglichkeit auftreten. Dabei werden Ausdehnung, Stabilisierung und Rückbildung der "blebs" vermutlich durch eine gemeinsame zelluläre Maschinerie kontrolliert, die sowohl die Organisation und Integrität des Zytoskeletts als auch dessen Interaktion mit der PM beeinflusst. Eine wichtige Rolle spielt dabei die Rho Kinase ROCK, deren Aktivität notwendig für PM "blebbing" ist. In dieser Studie wurden SH4-Domänen als neuartiger Auslöser für PM "blebbing" identifiziert. SH4-Domänen sind die Ankerdomänen bestimmter peripherer PM Proteine wie der protoonkogenen Src Kinasen und des Oberflächenproteins HASPB des Leishmania Parasiten. Sie werden durch acetylierte und gesättigte Kohlenwasserstoffketten, teils unterstützt durch basische Bereiche in der Aminosäuresequenz an die PM gebunden. Es stellte sich heraus, dass diese Assoziation an die PM notwendig für die Induktion von SH4-Domänen vermitteltem PM "blebbing" war, welches Kinetiken aufwies, die vergleichbar mit beschriebenen PM "blebbing" Phänotypen waren. Darüber hinaus stand dieser dynamische Prozess allein unter der Kontrolle eines auf Rho, jedoch nicht auf Rac oder Cdc42 basierenden GTPase Signalweges, wurde durch ROCK Aktivität und Myosin II ATPase reguliert und benötigte sowohl F-Aktin- als auch Mikrotubuli-Integrität. Als neuer regulierender Faktor wurden Src Kinasen bestimmt, da endogene Src Kinase Aktivität essentiell für SH4-Domänen induziertes PM "blebbing" war. Darüber hinaus waren SH4-Domänen induzierte PM "blebs" sowohl mit aktivem c-Src als auch mit aktivem ROCK angereichert. Es bestand eine funktionelle Korrelation von SH4-Domänen induziertem PM "blebbing" sowohl mit einer erhöhten zellulären Aufnahme flüssiger Bestandteile als auch mit einer erhöhten Zellinvasion in 3D Matrizen, welche in direktem Zusammenhang mit der amöboiden Form der Zellwanderung metastasierender Tumorzellen steht. Tatsächlich zeigten SH4-Domänen exprimierende CHO Zellen auch in 3D Umgebungen eine ähnliche "bleb" Morphologie und ihre Invasivität war vergleichbar mit der von MDA-MB-435 Brustkrebszellen, was auf eine neue zelluläre Funktion dieser Ankerdomänen hinweist. Auch das "diaphanous related formin" FHOD1 konnte, basierend auf RNAi vermittelter Herunterregulierung, als Faktor für SH4-Domänen induziertes PM "blebbing" identifiziert werden. In Koexpression mit ROCK1 war FHOD1 in Abhängigkeit von seiner Fähigkeit zur F-Aktin-Nukleierung und möglicherweise durch direkte Interaktion mit ROCK1 an der Induktion von nicht-apoptotischem PM "blebbing" beteiligt. Dabei war Src Kinase Aktivität sowohl für die Induktion von PM "blebs" als auch für Interaktion von FHOD1 mit ROCK1 notwendig, was auf ein direktes Zusammenspiel dieser Faktoren hinweist. In einem in dieser Studie aufgestellten hypothetischen Modell sind c-Src und ROCK1 verantwortlich für PM Assoziation und Regulation der "blebbing" Maschinerie. FHOD1 vermittelte F-Aktin Polymerisierung ist hingegen notwendig für die Organisation des Zytoskeletts während des "blebbing" Vorganges, möglicherweise mit Unterstützung anderer Formine. Schließlich konnte unter Verwendung eines neuen FHOD1 spezifischen Antikörpers gezeigt werden, dass endogenes FHOD1 in tierischen Zellen in perinukleären, Golgi ähnlichen Bereichen lokalisierte. Zusätzlich zu seiner Rolle in SH4-Domänen vermitteltem PM "blebbing" war es jedoch durch RNAi vermittelte Herunterregulierung nicht möglich, weitere Funktionen für FHOD1 zu ermitteln, weder in Bezug auf seine Golgi Assoziation noch auf seine postulierten Funktion für F-Aktin-Organisation. Zusammenfassend wurden sowohl Src Kinasen als auch FHOD1 als neue Bestandteile einer zellulären Maschinerie identifiziert, die von Rho-ROCK Aktivität abhängig war und von SH4-Domänen gesteuert wurde. Ferner weisen die hier beschriebenen Ergebnisse auf ein neuartiges Zusammenspiel von SH4-Domänen, Src Aktivität, ROCK Signalwirkung und FHOD1 vermittelte Zytoskelett Umgestaltung hin. Da PM "blebbing" mit erhöhter zellulärer Aufnahme flüssiger Bestandteile und erhöhter Zellwanderung in 3D Umgebungen korrelierte, könnte SH4-Domänen vermittelte PM Dynamik einen Mechanismus darstellen, der die Invasivität von Zellen beeinflusst, die durch SH4-Domänen-haltige Onkoproteine transformiert wurden.

Translation of abstract (English)

The plasma membrane (PM) of animal cells represents a dynamic lipid bilayer which is constantly remodeled and adapted to cellular demands e.g. by formation of protrusions such as lamellipodia, filopodia or membrane ruffles. Spherical PM blebs are another type of protrusions and are generated after exposure to specific triggers in distinct circumstances including e.g. apoptosis, secretion and cell motility. They are thought to be controlled by a common blebbing machinery which orchestrates bleb expansion, retention and retraction by influencing cytoskeletal organization and integrity as well as its interaction with the PM. A key factor in PM blebbing is the Rho kinase ROCK which activity is required for PM blebbing. First, SH4-domains were identified as novel trigger for non-apoptotic PM blebbing. These anchoring domains of peripheric PM proteins such as the proto-oncogenic Src kinases or the cell surface protein HASPB of Leishmania parasites are attached to the PM via acetylated and saturated hydrocarbon chains, in some cases in combination with basic clusters. PM association was required for induction of PM blebbing which showed kinetics similar to other described PM blebbing phenotypes. Consistently, this dynamic process was controlled by Rho but not Rac or Cdc42 GTPase signaling pathways, was regulated by the activities of ROCK kinase and myosin II ATPase and was dependent on the integrity of F-actin as well as microtubules. In addition, Src kinases were identified as novel determinants in regulation of PM blebbing. Endogenous Src kinase activity was essential for PM blebbing in SH4-domain expressing cells. Active c-Src as well as active ROCK were enriched in PM blebs. As a functional consequence, SH4-domain mediated PM blebbing correlated with enhancement of fluid-phase uptake as well as cell invasion in 3D matrices which is connected to the amoeboid mode of cell migration in metastasizing tumor cells. In fact, CHO cells expressing SH4-domains also showed PM blebbing in 3D environments and their invasiveness closely matched that of MDA-MB-435 breast cancer cells indicating a novel function of these anchoring domains. Second, the diaphanous related formin FHOD1 was identified in RNAi based knockdown experiments to be involved in SH4-domain induced PM blebbing. Consistently, co-expressed with ROCK1, FHOD1 participated in non-apoptotic PM blebbing dependent on its formin specific ability to nucleate F-actin and possibly related to its binding to ROCK1. Induction of PM blebbing as well as binding required Src kinase activity, suggesting a direct interplay between these factors. In a here postulated hypothetical model, c-Src and ROCK1 are responsible for PM association and regulation of the blebbing machinery. In this scenario FHOD1 mediated F-actin polymerization is required for cytoskeletal rearrangements during PM blebbing possibly in combination with other formins. Finally, by application of a novel FHOD1 specific antibody it was demonstrated that endogenous FHOD1 localized in a perinuclear and Golgi related region. In knockdown experiments, however, additional functions beyond its contribution to PM blebbing were not detected, neither in relation to its Golgi association nor to its supposed capability of F-actin reorganization. Collectively, Src kinases as well as FHOD1 were identified as compounds of a cellular machinery that involves Rho-ROCK activity and regulates SH4-domain triggered PM blebbing. These results suggest a novel interplay between SH4-domains, Src activity, ROCK signaling and FHOD1 mediated cytoskeletal rearrangements. Since PM blebbing was correlated with enhanced fluid-phase uptake and 3D motility, SH4-domain mediated PM dynamization might be a mechanism that influences invasiveness of cells transformed by SH4-domain containing oncoproteins.