English Title: Via structure-function-relationships to the architecture of ribozymes for a Diels-Alder-reaction

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Abstract

Bislang war nur wenig bekannt über die Struktur und Reaktionsmechanismen künstlicher Ribozyme. Von der Arbeitsgruppe Jäschke wurde 1999 ein künstliches hergestelltes Ribozym beschrieben, das eine Diels-Alder-Cycloadditionsreaktion katalysiert [1]. In der vorliegenden Arbeit wurden Struktur-Funktions-Beziehungen auf verschiedenen Ebenen untersucht: Zum einen auf der Ebene der Nukleotide durch konventionelle Mutagenese, zum anderen auf der Ebene funktioneller Gruppen entweder durch atomare Mutagenese mittels ortsspezifischer Substitutionen oder durch Nucleotide Analog Interference Mapping (NAIM). Die Existenz und Lage der drei helikalen Bereiche des Ribozyms konnte durch doppelte, komplementäre Basensubstitutionen in Aktivitätswiederherstellungsversuchen gestützt und somit die zuvor angenommene Sekundärstruktur bestätigt werden. Der Annahme folgend, dass das katalytische Zentrum des Ribozyms von den einzelsträngigen Bereichen ausgebildet wird, wurden durch Substitution einzelner Basen die Konservierungsgrade aller Positionen dieser Bereiche bestimmt. Durch einzelne 2´-Desoxynukleotidsubstitutionen an denselben Positionen wurde die Rolle der 2´-Hydroxylgruppen im Ribozymmolekül untersucht. Hierbei wurde insbeson-dere die Wichtigkeit der 2´-Hydroxylgruppe des Nukleotides G9 als Teilnehmer im zentralen Wasserstoffbrücken-Netzwerk des aktiven Zentrums deutlich. Darüber hinaus wurde die Bedeutung verschiedener Ringstickstoffe, Aminogruppen und Carbonylgruppen in NAIM-Experimenten untersucht. Hier stand unter anderem die G9-Aminogruppe im Fokus des Interesses, da diese offenbar mit einer Carbonylgruppe des Maleimid-Substrates interagiert. Daher könnte ihr eine wichtige Funktion im Katalysemechanismus zukommen. Im Rahmen der NAIM-Experimente konnten ferner Rückschlüsse auf die Wichtigkeit einzelner Magnesium-ionen zur Tertiärstrukturbildung gezogen werden. Zu diesem Zweck wurde die Rolle der nicht verbrückenden Phosphatsauerstoffe durch den Einbau von Phosphorothioatanaloga untersucht. Mit ihrer Etablierung gelang es erstmalig, die NAIM-Technik an einem nicht RNA-spaltenden Ribozym anzuwenden. Der Einbau einer zusätzlichen Anthracen-Modifikation erforderte die Lösung besonderer technischer Probleme, die durch spezielle und zum Teil selbstentwickelte Methoden gelöst werden konnten. Tertiäre Interaktionen des Pseudoknotenbasenpaares G1-C11 konnten erstmals durch eine partielle Aktivitätswiederherstellung in der Doppelmutante G1-C11 → iso-G1-iso-C11 zweifelsfrei nachgewiesen werden. In RNA/DNA/2´-OMe-RNA-Chimären war es möglich, die Anzahl der benötigten Ribonukleo-tide auf elf zu senken, bei weitgehender Erhaltung der Katalyseaktivität. Weiterhin gelang es, die Aktivitätsdaten der Chimären in einen strukturellen Zusammenhang zu bringen, wobei insbesondere die Relevanz sterischer Hinderungen im Bereich der engen Schleife A18-C21.4 zu Tage trat. Auch die strukturelle Bedeutung der Helix II-Geometrie wurde in diesem Zusammenhang untersucht und diskutiert. Insgesamt konnte eine exzellente Übereinstimmung der Mutations- und Probingdaten untereinander sowie mit der kürzlich gelösten Kristallstruktur festgestellt werden. Bezüglich einer möglichen Quartärstruktur ergaben sich keine Anhaltspunkte für die Existenz von Di- oder Oligomeren, wodurch die Annahme einer monomeren Ribozymform gestützt wird. Atypisches kinetisches Verhalten legte eine partielle Inaktivierung des Ribozyms nahe. Zur Stützung dieser These wurde nach kovalenten Modifizierungen aus Nebenreaktionen gesucht; hierauf fanden sich jedoch keine Hinweise. Schließlich konnte experimentell gezeigt werden, dass auf dem Faltungsweg des Oligonukleotids die Ausbildung der Sekundärstruktur der geschwindigkeitsbestimmende und wesentlich langsamere Schritt gegenüber der Tertiärstrukturbildung ist. Durch die Integration aller Informationen aus Charakterisierungsexperimenten wurde verfeinerter computerunter-stützter Modellbau der Tertiärstruktur ermöglicht. Darüber hinaus konnten Hypothesen zum Faltungsweg und zum Reaktionsmechanismus formuliert werden, die als Ausgangspunkt für zukünftige, z.B. physikochemische Experimente dienen können.

Translation of abstract (English)

Until now there is only little knowledge about the structure and reaction mechanisms of artificially produced ribozymes. In 1999, an artificial ribozyme catalysing a Diels-Alder-cycloaddition reaction was described by the Jäschke group [1]. This work focuses on structure-function-relationship on different levels: On the one hand at the level of nucleotides by conventional mutagenesis, on the other hand at the level of functional groups either by atomic mutagenesis using site-specific substitutions or by Nucleotide Analog Interference Mapping (NAIM). The existence and location of the three helical regions of the ribozyme could be supported by twofold complementary base substitutions in activity rescue experiments and therefore the previously assumed secondary structure. Following the assumption, that the catalytic center of the ribozyme is formed preferentially by the single stranded regions, the degrees of conservation concerning all positions of these regions were determined. Using single 2´-deoxynucleotide substitutions at the same positions the role of 2´-hydroxyl residues being part of the ribozyme were investigated. In particular the importance of the 2´-hydroxyl residue of nucleotide G9 as part of the central hydrogenbond-network of the active center became obvious. Additionally the role of different ring nitrogens, amino- and carbonyl groups were investigated in NAIM-experiments. In this regard among other functional groups the G9-amino group moved into the focus of interest, because it apparently interacts with a carbonyl group of the maleimide substrate and therefore could play an important role concerning the catalytic mechanism. Referring to NAIM-experiments, conclusions about the importance of single magnesium ions concerning tertiary structure formation could be drawn. For this purpose the role of non-bridging phosphate oxygens were investigated by incorporating phosphorothioate analogs. By establishing the technique successfully, NAIM was performed with a non RNA-cleaving ribozyme for the first time. The incorporation of an adding modification of anthracene caused severe technical problems, which could be solved by special and partially self-developed methods. For the first time tertiary interactions of the pseudoknot basepair G1-C11 could be undoubtedly proven by a partial activity rescue showed by the double mutant G1--C11 → iso-G1--iso-C11. By producing chimeric RNA/DNA/2´-OMe-RNA constructs, the number of needed ribonucleotides could be reduced to eleven with only moderate loss of activity. Furthermore the activity data of chimeres could be brought into a structural context showing the relevance of sterical hindrances in the region of the sharp turn A18-C21.4. In this regard the structural role of the helix II-geometry was examined and discussed. In general an excellent agreement between the data collected by mutational analysis and other characterisation experiments, e.g. chemical probing, as well as the recently solved crystal structure could be stated. Concerning a possible quarternary structure no indications for the existence of di- or oligo-meres were found, supporting the assumption of a monomeric ribozyme form. Atypic cinetical behaviour seemed to indicate partial ribozyme inactivation. In order to support this hypothesis, the search was directed to covalent modifications derived from sidereactions, however no such indications were found. Finally, it could be experimentally shown, that the formation of the secondary structure is the rate limiting and much slower step in comparison to the tertiary structure formation. By integrating all informations derived from characterisation experiments, refined computational modelling of the tertiary structure became possible, furthermore some hypotheses concerning the folding pathway and reaction mechanism could be formulated serving possibly as a basis for coming trials, e.g. physicochemical experiments.