German Title: Funktionelle Analyse von Nt-Hypo1 und NtPLC3, zweier neuer pollen-spezifischer Proteine aus Nicotiana tabacum

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Abstract

Pollenschläuche stellen ein ideales Modellsystem zur Erforschung der Prozesse dar, die pflanzliches Spitzenwachstum steuern oder regulieren. Pollenschläuche sind longitudinale Zellen, die äußerst schnell und zielgerichtet durch das weibliche Blütengewebe wachsen und der Übertragung männlicher Geschlechtszellen in die Samenanlage und somit der Befruchtung der Eizelle dienen. Um den hochkomplizierten Prozess des polaren Wachstums gewährleisten zu können, müssen in der Zelle zahlreiche Signalübertragungsprozesse in Gang gesetzt, um dem Pollenschlauch seinen Weg zu weisen und ausreichend Zellwand- bzw. Plasmamembranmaterial zur Verfügung zu stellen. Man geht davon aus, dass pflanzliche Homologe der Rho-Familie kleiner GTPasen im Zusammenspiel mit PI-4,5-P2 eine wichtige Aufgabe der Signaltransduktion übernehmen und somit eine ganz entscheidende Rolle in der Regulation des Spitzenwachstums einnehmen. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit zwei voneinander unabhängigen Projekten. Das zu Anfang beschriebene Projekt repräsentiert das Nebenprojekt. Die Intention des Projektes war es, einen pflanzen-spezifischen Guanine-Nukleotid-Exchange-Faktor (GEF) zu identifizieren. Zu Beginn der Dissertation war die Aktivierung der Rac/Rop GTPasen im Pflanzenreich noch nicht geklärt und pflanzen-spezifische Rho GEFs waren bislang nicht identifiziert. In einem zwei-Hybrid-Interaktionsversuch, in dem eine dominant negative Mutante der kleinen GTPase Nt-Rac5 aus Tabak als “bait” eingesetzt wurde, haben wir ein Protein identifiziert, das 76 Aminosäuren umfasst. Dieses hypothetische Protein interagierte mit Nt-Rac5 in Hefezellen sowie in in vitro pull-down Experimenten. Nt-Hypo1 ist ein pollenspezifisches, lösliches Protein, das im Zytoplasma der Pollenschläuche akkumuliert. Durch RNA-Interferenz wurden transgene Tabak-Pflanzen erzeugt, in denen die Expression des hypothetischen Proteins ausgeschaltet wurde. Diese Pflanzen werden weiterhin in bezug auf Defekte im Pollenschlauchwachstum und der Fertilisation untersucht. Weitere Experimente werden durchgeführt, um die Frage nach der Funktion des hypothetischen Proteins bzw. seine Beteiligung in einem Multi-proteinkomplex mit potentieller GEF-Aktivität zu beantworten. Das Hauptprojekt dieser Dissertation befasst sich mit der Identifizierung und funktionellen Charakterisierung einer Phosphoinositid-spezifischen Phospholipase C aus Tabak. PI-PLCs sind Ca2+-abhängige Enzyme, die PI-4,5-P2 hydrolysieren und dabei die Botenstoffe Diacylglycerol und Inositol 1,4,5-trisphosphat bilden. DAG verbleibt mit der Membran assoziiert, InsP3 hingegen diffundiert ins Zytoplasma, öffnet möglicherweise Ca2+-Kanäle und erhöht somit die intrazelluläre Ca2+-Konzentration. PI-4,5-P2 spielt eine bedeutende Rolle in der Regulation des polaren Pollenschlauchwachstums und arbeitet dabei zusammen mit Rac/Rop GTPasen. Die Intention dieses Projektes war es, eine Verbindung der PI-PLCs mit Rac/Rop GTPasen, PI-4,5-P2 und der Etablierung eines spitzen-fokussierten Ca2+-Gradienten herstellen, die alle nachweislich an der Regulation des pflanzlichen Spitzenwachstums beteiligt sind. Wir haben eine neue pollenspezifische PI-PLC Isoform, NtPLC3, aus Tabak durch Kolonie-Hybridisierung isoliert sowie ihre Lokalisierung in Pollenschläuchen durch YFP-Markierung in vivo bestimmt. Überdies haben wir durch die Herstellung einzelner Deletionsmutanten gezeigt, dass zwei Domänen, die EF-Hand, sowie die C2 Domäne, essentiell für die Membranbindung der PI-PLC sind. Die Herstellung von Chimären aus pflanzlichen und tierischen PI-PLC Domänen hat weiterhin gezeigt, dass Regionen im katalytischen Zentrum dafür verantwortlich sind, NtPLC3 von der Membran an der Pollenschlauchspitze fernzuhalten, unabhängig davon, ob das Enzym aktiv ist oder nicht. Weiterhin haben wir gezeigt, dass NtPLC3 Ca2+-abhängig PI-4,5-P2 in vitro hydrolysiert und die Hydrolyse entweder durch einfache Punktmutationen im katalytischen Zentrum oder durch das Aminosteroid U-73122 gehemmt werden kann. Durch den Einsatz der PH-Domäne der tierischen PI-PLC d1, der als Bioindikator für PI-4,5-P2 dient, haben wir die komplementäre Anordnung von PI-4,5-P2 und NtPLC3 in vivo gezeigt. Basierend auf den beschriebenen Experimenten und der Beobachtung, dass sich PI-4,5-P2 an der Plasmamembran in der Pollenschlauchspitze nach Inhibitor-Zugabe ausbreitet, schließen wir, dass PI-PLCs die lokal begrenzte Verteilung von PI-4,5-P2 kontrollieren. Unsere Daten zeigen, dass PI-PLCs essentiell am pflanzlichen Spitzenwachstum beteiligt sind. Wir schlagen daher vor, dass eine Schlüsselfunktion der PI-PLCs in Pollenschläuchen die räumliche Begrenzung der PI-4,5-P2-Verteilung in der Spitze der Pollenschläuche ist und sie somit gewährleisten, dass Aktin-bindende Proteine sowie Proteine, die Vesikel¬fusionen mit der Plasmamembran begünstigen, lokal an PI-4,5-P2 in der Spitze binden können und auf diese Weise das polare Wachstum gewährleistet wird.

Translation of abstract (English)

Pollen tubes are an excellent model system to investigate molecular mechanisms controlling polar plant cell growth, a process that is essential for cellular and organ morphogenesis throughout plant development. Pollen tubes are large cells that grow rapidly in a strictly polar manner through female flower tissue and transport sperm cells enclosed in their cytoplasm to egg cells. Thus, in only a short time period they grow up to several centimeters to reach the embryo sac and to ensure fertilization. To guarantee the highly complex process of polarized growth, several cellular signal transduction cascades have to be initiated or enhanced in order to guide the pollen tube´s way through the style and to deliver cell wall and plasma membrane material to the site of maximum growth, the tip. Although to date only little is known about the mechanisms involved in tip growth, it is known that plant homologues of the Rho family of small GTPases act in a common pathway with PI-4,5-P2 and represent key regulators of polarized cell growth. The present dissertation focused on two independent subjects. The first and minor project represents the attempt to identify a plant-specific guanine nucleotide exchange factor (GEF). When the work presented here was initiated, it was unclear how plant Rac/Rop GTPases are activated and no Rho GEF had been identified in the plant kingdom. In a yeast two-hybrid screen using a dominant negative mutant of the tobacco small GTPase Nt-Rac5 as bait, we identified a novel protein of 76 amino acids. This hypothetical protein interacted with Nt-Rac5 in yeast cells and in in vitro pull-down assays. It was shown to be a pollen-specific, soluble protein that accumulated in the cytosol of growing pollen tubes. Loss-of-function mutant plants have been generated by RNA interference and are still under investigation. Further experiments are in progress to finally solve the question whether Nt-Hypo1 is a plant-specific GEF or not. The second and major project of this dissertation represents the identification and functional characterization of a phosphoinositide-specific phospholipase C from tobacco. PI-PLCs are Ca2+-dependent enzymes that hydrolyze PI-4,5-P2 and generate two second messengers: Diacylglycerol remains associated with the plasma membrane, whereas inositol 1,4,5-trisphosphate diffuses to the cytosol where it opens Ca2+ channels and thereby increases the intracellular Ca2+ concentration. PI-4,5-P2 is known to play an important role in the regulation of polarized pollen tube growth acting together with Rac/Rop GTPases. In this dissertation we intended to solve the question if PI-PLCs represent a link between Rac/Rop GTPases, PI-4,5-P2 and the establishment of a tip-focused Ca2+ gradient, which all have key functions in the regulation of pollen tube tip growth. We identified a novel pollen-specific PI-PLC isoform, NtPLC3, from tobacco by cDNA library colony hybridization and determined its localization in living pollen tubes by YFP-tagging. Furthermore, through the generation of single- or multiple-domain deletion mutants, we showed that two domains, the EF hand and the C2 domain, are both essential for membrane association of this enzyme. The generation of chimeric constructs, combining plant and mammalian PI-PLC domains, showed that regions within the catalytic core of NtPLC3 kept PI-PLCs from associating with the plasma membrane in the pollen tube tip, whether the enzyme was active or not. We moreover demonstrated that NtPLC3 hydrolyzed PI-4,5-P2 in a Ca2+-dependent manner in vitro. This activity could be significantly reduced by introducing single amino acid exchanges into the catalytic core of the enzyme or by treatment with the aminosteroid U-73122. Using the PH domain of the mammalian PI-PLC d1 as a biosensor for PI-4,5-P2, we visualized the complementary distribution of this lipid, which is a PI-PLC substrate, and of NtPLC3 in vivo. Based on the experiments and on the observation that PI-4,5-P2 spreads to a larger area of the plasma membrane at the pollen tube tip after U-73122 treatment, we concluded that PI-PLCs restrict PI-4,5-P2 to the pollen tube apex. Our data demonstrate that PI-PLC activity is essential for pollen tube growth. We propose that a key function of PI-PLCs in pollen tubes is to limit PI-4,5-P2 distribution to the tip and thereby ensure spatially restricted binding of e.g. actin-binding proteins or proteins that mediate vesicle fusion with the plasma membrane. Based on this mechanism, pollen tube PI-PLC activity plays a key role in maintaining polarization of cell expansion.