German Title: Untersuchung zur Protein-Protein Wechselwirkungen bei der Organisation Cytoskelett-ähnlicher Struktur in Mycoplasma pneumoniae

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Abstract

Mycoplasma pneumoniae has a cytoskeleton-like structure. Based on genetic evidence, it was proposed that the 1818 amino acids long protein HMW2 plays a central role in both formation of the cytoskeleton-like structure and adherence to its host cell (cytadherence). As gene products of the hmw2 gene (MPN310), two proteins were identified, the full-length protein HMW2 with a molar mass of 216 kDa and a smaller one (HMW2-s) with only 25 kDa. HMW2-s was considered to be the processing product of HMW2, but it could be shown by determining the N-terminus of HMW2-s and by expression studies with an artifical hmw2-s gene in M. pneumoniae that HMW2-s was synthesized by a new internal start within the hmw2 gene but in the same raster as HMW2. This internal expression unit also ensures the transcription of the two genes, MPN311 and MPN312, located immediately downstream. To characterize HMW2, it was expressed in Escherichia coli under various condition and with alternative E. coli strains, but, it was poorly expressed and degraded rapidly independent of the applied conditions. Therefore, it was impossible to isolate enough soluble full-length protein to do biochemical and structural analyses. The proposed function of HMW2 requires its interaction with other proteins of M. pneumoniae. Pilot experiments with the two-hybrid system suggested several candidates. By applying the “pairwise tests”, an internal fragment of HMW2 was found to interact with the C-terminal fragment of HMW1 (MPN447) and with the MPN297 encoded 17-kDa protein. The latter one has not yet been implicated in cytoskeleton formation. In addition, the interaction between the main adhesin P1 with HMW1 and the gene product of MPN297 was established linking indirectly HMW2 to the P1 adhesion complex consisting of at least three proteins: P1, P40 and P90. Further evidence for the interaction between HMW2 and the P1 adhesin (complex) derived from comparative protein analyses of M. pneumoniae WT and the mutant M. pneumoniae A3 (hmw2−). Western blot analyses showed that in M. pneumoniae A3 the turnover rate of the proteins of the P1 complex was significantly higher. This was interpreted as a consequence of the missing binding partner, because without HMW2, the P1 complex can not be formed and inserted properly in the membrane, making those proteins useless for the bacterium. First attempts to isolate protein complexes containing HMW2, to which a TAP tag was fused, were succesful. Twelve genes/ proteins were identified from the purified complexes: MPN015, MPN140 (ORF4 gene product), MPN141 (P1), MPN142 (P90), MPN160, MPN297, MPN392 (PdhB), MPN426 (P115), MPN430 (GAPDH), MPN447 (HMW1), MPN573 (GroEL), MPN665 (EF-Tu). These results confirm the two-hybrid analyses of proteins interacting with HMW2. Eight of them (P1, P90, PdhB, GAPDH, HMW1, GroEL, EF-tu and the gene product of MPN297) were also found in the Triton X-100 insoluble fraction, which contains almost all of the known cytoskeletal proteins including HMW2. Furthermore, the interaction of HMW2 with EF-Tu (elongation factor Tu) and PdhB (pyruvate dehydrogenase E1-beta subunit), of which a subfraction was reported to be surface exposed, provide evidence, that HMW2 might also have an important function in organizing other proteins than cytoskeletal proteins. Finally, a new antiserum against the N-terminal part of HMW2 was generated, which improved the immunocytochemistry and allowed to co-localize HMW2 with the rod structure (co-operation with Dr. Hegermann), which is one of the predominant structures seen in thin sections of M. pneumoniae.

Translation of abstract (German)

Mycoplasma pneumoniae besitzt eine Cytoskelett-ähnliche Struktur. Auf der Grundlage der Ergebnisse genetischer Experimente wurde vorgeschlagen, daß das 1818 Aminosäuren große Protein HMW2 eine zentrale Rolle bei der Organisation Cytoskelett-ähnlicher Strukturen und bei der Anheftung an die Wirtszelle (Cytadhärenz) spielen würde. Als Genprodukte des Gens hmw2 (MPN310) wurden zwei Proteine identifiziert, das vollständige HMW2 Protein mit einer molaren Masse von 216 kDa und ein kleineres Protein mit einer molaren Masse von nur 25 kDa (HMW2-s). Letzteres wurde bisher als Prozessierungsprodukt von HMW2 angesehen, aber in der vorliegende Arbeit konnte durch Bestimmung des N-terminus von HMW2-s und Expressionsstudien mit einem künstlichen Gen hmw2-s gezeigt werden, daß HMW2-s von einem internen Start-Codon von hmw2 neu synthetisiert wird. Zum Zweck der weiteren Charakterizierung wurde HMW2 in Escherichia coli unter verschiedene Bedingungen und mit alternativen Stämmen exprimiert. Es war aber nicht möglich, ausreichend lösliches, vollständiges HMW2 zu synthetisieren, um biochemische und strukturelle Analysen durchzuführen, da HMW2 in E. coli nur schwach exprimiert und zudem schnell abgebaut worden ist. Die vorgeschlagene Funktion von HMW2 erfordert dessen Wechselwirkung mit anderen Proteinen von M. pneumoniae. In Pilotexperimenten mit dem “Two-hybrid system” wurden mehrere Kandidaten gefunden. Durch Anwendung des “Pairwise tests” konnte gezeigt werden, daß ein internes Proteinfragment von HMW2 sowohl mit dem C-terminalen Proteinfragment von HMW1 (MPN447) als auch einem Protein von 17 kDa, dem Genprodukt von MPN297, in Wechselwirkung steht. Letzteres war bisher noch nicht mit der Ausbildung des Cytoskeletts in Verbindung gebracht worden. Außerdem wurde die Wechselwirkung zwischen dem P1 Adhäsionskomplex, bestehend aus den Proteinen P1, P40 und P90, und HMW1 und dem Genprodukt von MPN297 nachgewiesen und damit indirekt eine Wechselbeziehung zwischen HMW2 und P1 hergestellt. Zusätzliche Hinweise auf eine Wechselwirkung von HMW2 und dem P1 Komplex kamen von vergleichenden Proteomanalysen zwischen M. pneumoniae WT und der hmw2 Mutante M. pneumoniae A3, die zeigten, daß die Abbaurate der Proteine des P1 Komplexes in der Mutante deutlich höher waren. Das wurde damit erklärt, daß in Abwesenheit des Bindungspartners HMW2 der P1 Komplex nicht gebildet und daher auch nicht in die Membran integriert werden kann und dessen Komponenten aus diesem Grund, als nutzlos angesehen, schneller abgebaut werden. Erste Versuche, Proteinkomplexe zu isolieren, die HMW2 enthielten, welches durch ein Peptid (TAP-tag) modifiziert waren, verliefen erfolgreich. In angereicherten Komplexen konnten zwölf verschiedenen Proteine identifiziert werden: MPN015, MPN140 (ORF4 gene product), MPN141 (P1), MPN142 (P90), MPN160, MPN297, MPN392 (PdhB), MPN426 (P115), MPN430 (GAPDH), MPN447 (HMW1), MPN573 (GroEL), MPN665 (EF-Tu). Damit wurden die Ergebnisse der „Two-hybrid“ Analyse bestätigt. Acht der zwölf Proteinen (P1, P90, PdhB, GAPDH, HMW1, GroEL, EF-Tu und das Genprodukt von MPN297) wurden außerdem in der Triton X-100 unlöslichen Fraction von M. pneumoniae gefunden. In dieser Fraktion sind alle bisher bekannten Cytoskelett-Proteine, einschließlich HMW2, angereichert. Die Wechselwirkung zwischen HMW2 und EF-Tu (Elongationsfaktor Tu) und PdhB (E1-beta Untereinheit der Pyruvatdehydrogenase), die nach Berichten teilweise Oberflächen-exponiert sind, zeigt, daß HMW2 auch bei der Organization solcher Proteine eine Rolle spielen könnte, die nicht an der Bildung des Cytoskeletts beteiligt sind. Schließlich wurde noch ein Antiserum gegen die N-terminale Region von HMW2 synthetisiert. Damit konnte eine verbesserte Immunogold-Elektronenmikroskopie durchgeführt werden, welche es erlaubte, HMW2 mit der „rod“ Struktur, einer besonders markanten, in Ultradünnschnitten sichtbaren Struktur, zu co-lokalisieren (Zusammenarbeit mit Dr. Hegermann).