German Title: DFer Protein Tyrosin Kinase : Ihr Zusammenhang mit dem Amyloid Vorläufer Protein (APP)-induziertem Flügelphänotyp und ihre funktionelle Charakterisierung in Drosophila melanogaster

Preview

PDF, German Download (50MB) | Terms of use

Abstract

Das “Amyloid Precursor Protein” APP ist das Vorläuferprotein des A?-Peptides, welches als Bestandteil der amyloiden Plaques im Gehirn von Alzheimer Patienten auftritt. Obwohl die Entstehung von A? durch die proteolytische Spaltung von APP sehr gut untersucht ist, ist die physiologische Funktion von APP weitgehend unbekannt. Die APP zugesprochenen biologischen Aktivitäten umfassen auch eine Funktion in der Zelladhäsion und in intrazellulären Signalwegen. In früheren Studien wurde die Fruchtfliege Drosophila melanogaster als Modellsystem genutzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Expression von APP während der Flügelentwicklung zu einer Blasenbildung („blistered wing“ Phänotyp) im Flügel führt, einem Zelladhäsionsdefekt, der auf eine Funktion von APP in der Zelladhäsion hinweist. Basierend auf diesem Phänotype wurde ein genetischer Screen durchgeführt und zahlreiche Suppressoren des APP induzierten Phänotyps isoliert. In der vorliegenden Arbeit wurden diese genetischen Interaktoren identifiziert. Die neun stärksten Suppressoren kodieren für Proteine involviert in Zell-Zelladhäsions-Prozessen, Calcium-Signalwegen, Organisation des Zytoskeletts und transkriptionelle Regulation. Eines der Proteine, die DFer Protein-Tyrosin Kinase, deren Funktion in Drosophila unbekannt ist, wurde weitergehend untersucht. Mithilfe eines transgenen Ansatzes konnte die genetische Interaktion zwischen APP und dfer verifiziert werden. Zellkultur- sowie in vivo-Experimente in Drosophila zeigten jedoch, dass die Interaktion zwischen den beiden Proteinen indirekt ist, ausgelöst durch generelle Interferenzen mit Zelladhäsion. Dementsprechend hatte die Expression von dfer weder einen Effekt auf den Metabolismus, die Prozessierung, die Phosphorylierung, noch auf die Sekretion von APP. Die DFer Kinase stellt das einzige Drosophila Homolog zur Fes und Fer Kinase von Säugetieren dar, die mit der Regulation von Zelladhäsion und zytoskelettalem Umbau vermittelt durch adhäre Verbindungen und fokalen Adhäsionen in Verbindung gebracht werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die DFer Kinase in ihrer funktionellen Regulation ihren vertebraten Homologen ähnelt und Tyrosin-Phosphorylierungsaktivität in vivo aufweist. Die dfer Expression im Fliegenembryo war besonders stark in Geweben, die morphologische Entwicklungsvorgänge durchlaufen, bei denen Zelladhäsionsprozesse eine wichtige Rolle spielen, insbesondere im Zentralen Nervensystem, an den Muskelbefestigungen, und den Zellen der Führungskante („leading edge“) während des dorsalen Rückenschlusses des Embryos. Im Gegensatz zu den vertebraten Homologen konnte für dfer gezeigt werden, dass mind. drei unterschiedliche Transkripte auftreten, deren Expression teilweise zeitlich und räumlich beschränkt ist. Durchgeführte Überexpressionstudien in Drosophila legen eine Rolle von DFer in der Modulation von Zelladhäsionsprozessen nahe. Das Entstehen von „blistered wing“ Phänotypen weist auf einen Verlust von Funktionen der Integrine hin. Das Fehlen von Flügelgewebe („wing margin notching“) kann als eine Beeinflussung des Notch- und Wingless-Signalweges interpretiert werden, wahrscheinlich bedingt durch einen Verlust von Zell-Zelladhäsionen. Dies wird unterstützt durch die Identifizierung von weiteren genetischen Faktoren, die diese Phänotypen beeinflussen. Da die Überexpression der vertebraten Homologe gleiche Phänotypen hervorrief, kann von einer funktionellen Konservierung zwischen den Proteinen ausgegangen werden. Des weiteren wurden dfer mutante Fliegen hergestellt, die lebensfähig und fruchtbar sind und damit bestätigen, dass dfer für die Entwicklung von Drosophila nicht essentiell ist. Überraschenderweise konnten nur sehr kleine Deletionen generiert werden, die weiterhin ein funktionelles DFer Protein produzieren, oder sehr große Deletionen. Mutanten mit großen Deletionen erwiesen sich als letal. Es konnte gezeigt werden, dass neben dfer drei weitere Gene entfernt wurden. Experimente mit genomischen Konstrukten belegten, dass eines dieser Gene, CG33188, ein für die Entwicklung essentieller neuronaler Transkriptionsfaktor ist. Obwohl die DFer Kinase nicht essentiell ist, weisen ca. 10% der Embryonen Defekte während des embryonalen dorsalen Rückenschlusses auf, ein Prozess, der Integrin- und Cadherin-vermittelte Zelladhäsion benötigt. Die Aufklärung der exakten Funktion von DFer während dieser Prozesse wird in der Zukunft wichtige Rückschlüsse auch auf die Funktion von APP in der Zelladhäsion offenbaren.

Translation of abstract (English)

The Amyloid Precursor Protein APP is the source of the A? peptide found in neuritic plaques of Alzheimer’s Disease patients. Although the A? generation from APP is well investigated, the actual physiological functions of APP remain still unclear. Nevertheless, multiple biological activities have been suggested, among these functions in cell adhesion and intracellular signaling. Using Drosophila melanogaster as a model system, it has been shown that overexpression of human APP during Drosophila wing development leads to cell adhesion defects visible as wing blisters, pinpointing to an involvement of APP in cell adhesion. Based on this APP-induced blistered wing phenotype, a genetic dominant modifier screen was performed and numerous suppressors isolated. In this study, the genetic modifiers of the APP-induced blistered wing phenotype were identified. The nine strongest suppressors encode for proteins involved in cell adhesion, calcium signaling, organization of the cytoskeleton and transcriptional regulation. One of the proteins, the DFer protein-tyrosine kinase with uncharacterized function in Drosophila, was further investigated. Using a transgenic approach, the genetic interaction between APP and DFer could be verified. However, the interaction between these proteins was revealed to be of an indirect nature caused through general interference with cell adhesion. This was evident from cell culture and in vivo experiments in the Drosophila organism, where dfer expression had no effect on APP metabolism, processing, phosphorylation and secretion. DFer kinase is the only Drosophila homolog of mammalian Fes and Fer kinases, which are implicated in the regulation of cell adhesion and cytoskeletal rearrangement mediated by adherens junctions and focal adhesions. Here, it could be shown that DFer kinase displays a functional regulation similar to its vertebrate homologs and showed tyrosine phosphorylation in vivo. In the fly embryo, dfer was ubiquitously expressed with particularly high levels in the developing CNS, at muscle attachment sites and in the leading edge cells during the morphological process of dorsal closure, interestingly, all sites of cell migration where adhesion takes place. In contrast to its vertebrate homologs, dfer produced at least three different transcripts, which seem to be in part spatially and temporally restricted. The results obtained from overexpression studies of dfer in Drosophila imply an accessory role in modulating cell adhesion processes. While ubiquitous expression resulted in lethality, more selective expression gives phenotypes such as wing blistering, characteristic for loss of integrin function. Another striking phenotype, wing margin notching, suggests an interference with the Notch and Wingless signaling pathways, probably by interfering with cell adhesion processes. Moreover, genetic modifiers of the overexpression phenotype were identified, encoding proteins with functions in cell adhesion. Overexpression of the mammalian fes and fer in Drosophila caused similar defects, supporting a functional conversation between these proteins. Dfer mutant flies were generated that are viable and fertile, demonstrating that dfer is not essential for developmental or physiological functions in Drosophila. Surprisingly, only very small deletions, resulting in functional DFer protein expression, or very large deletions were recovered. Mutants with large deletions displayed lethality, and it could be shown that three dfer neighboring genes were additionally deleted. With genomic rescue constructs containing these three genes, it could be revealed that one of them, CG33188, is an essential neuronal transcription factor. Although DFer kinase was shown to be not critical for Drosophila development, 10% of the Dfer mutant embryos displayed defects during dorsal closure, a process requiring integrin- and cadherin-mediated cell adhesion. The elucidation of DFer function during these processes in the future may shed also light on aspects of APP function in cell adhesion.