German Title: Molekulare Charakterisierung des putativen Onkogens myeov

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Abstract

The myeov gene was identified using the tumorigenicity assay with DNA from a patient suffering a gastric carcinoma. The Myeov gene is localized at chromosome band 11q13, a frequent site for chromosomal rearrangements in various carcinomas and B-cell neoplasms. The gene was shown to be involved in cases of multiple myeloma harboring the t(11;14)(q13;q32). In addition, myeov is coamplified with cyclin D1 and overexpressed in carcinomas of the breast, lung, bladder, esophageal squamous cell carcinomas and oral squamous cell carcinomas. Myeov DNA amplification and overexpression was detected in several carcinoma cell lines, however, hardly any MYEOV protein could be detected using specific antibodies in Western blot analysis. The 5 untranslated region (5UTR) of the myeov gene is long, encompasses four upstream AUG codons (uAUGs) and is predicted to fold in a strong secondary structure. These features are common among mRNAs regulated by their 5UTR and suggest that MYEOV protein synthesis might be regulated at a posttranscriptional level. These findings prompted us to investigate the possible role of the myeov 5UTR in controlling its protein level, and the possibility of MYEOV protein synthesis to be mediated by an internal ribosome entry site (IRES). Here we show that initial experiments using mono- and bicistronic reporter constructs supported this view. However, further examination by in vitro transcription/translation assays, Northern blot analysis and the application of promoterless constructs revealed promoter activity in the myeov 5UTR. Despite this strong promoter activity, we did not find any translation products. Our experiments showed that this was due to the presence of uAUGs codons present in the myeov 5UTR. DNA and RNA transfection of the wild type and mutated 5UTR, where the uAUGs were mutated to AAG, confirmed that these uAUGs abrogate translation of the reporter gene as well as the myeov gene. Alternative splicing mechanisms in specific cell types and/or developmental stages may be a way to evade this translation control.

Translation of abstract (German)

Das Myeov Gen wurde mittels eines Tumorigenizitätsassays aus der DNA eines Patienten mit einem Magentumor isoliert. Das Gen ist auf der Chromosomenbande 11q13 lokalisiert worden, einem häufig betroffenen Abschnitt für chromosomale Rekombinationen in verschiedenen Karzinomen und B-Zell-Neoplasien. Es ist nachweislich an Fällen multipler Myelome beteiligt, die eine t(11;14)(q13;q32) zeigen. Auch findet man Myeov zusammen mit Cyclin D1 koamplifiziert und überexprimiert in Karzinomen der Brust, der Lunge, der Blase, sowie in Epithelzellkarzinomen des Ösophagus und der Mundhöhle. Amplifikation und Überexpression von MYEOV wurden zwar in mehreren Karzinom-Zelllinien gezeigt, jedoch konnte in der Western-Blot-Analyse mit myeov-spezifischen Antikörpern kein Protein nachgewiesen werden. Die 5 nichttranslatierte Region (5UTR) des Myeov-Gens ist relativ lang, sie enthält vier vorgeschaltete AUG Kodons (uAUGs) und ist laut Prognose eines Computerprogramms in der Lage, eine starke Sekundärstruktur zu bilden. Diese Eigenschaften kommen häufig bei mRNAs vor, die durch ihre 5UTR reguliert werden und deuteten auch in unserem Fall darauf hin, daß die MYEOV-Proteinsynthese auf postranskriptionaler Ebene gesteuert sein könnte. Diese Entdeckungen veranlassten uns dazu, einerseits die mögliche Rolle der Myeov-5UTR bei der Regulation der Proteinexpression näher zu untersuchen, sowie andererseits zunächst die Möglichkeit zu überprüfen, ob die Proteinsynthese durch eine �internal ribosome entry site� (IRES) ermöglicht werden könnte. Erste Experimente mit mono- und bicistronischen Reporterkonstrukten schienen diese Ansicht zu stützen. Jedoch wies die weitere Prüfung durch in vitro-transcription/translation assays, Northern-Blot-Analyse und die Verwendung promotorloser Konstrukte auf eine Promotorfunktion der Myeov 5UTR hin. Doch trotz deutlicher Promotoraktivität fanden wir keine translatierten Produkte. Unsere Experimente zeigten schließlich, daß die Ursache in den uAUG Kodons der Myeov 5UTR zu suchen war. Die Transfektion verschiedener DNA- und RNA- Luciferase- Reporterkonstrukte mit Myeov 5UTR und parallel dazu einer mutierten Form, bei der die uAUGs zu AAG verändert worden waren, bestätigte, daß diese uAUGs die Translation des Reportergens sowie des Myeov-Gens verhindern. Alternatives Splicing in bestimmten Zell-Arten und/oder Entwicklungsstadien könnten eine Möglichkeit sein, diese Translationskontrolle zu umgehen.