English Title: Studies on noninvasive tetracycline dependent control of gene activities in vivo

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Abstract

Die konditionale Inaktivierung endogener Gene ist eine wirksame Strategie zur Analyse von Genfunktionen in transgenen Tieren. Den besten Beweis für die Funktionalität eines Genprodukts liefert hierbei die reversible Steuerung der Expression des zu untersuchenden Gens durch einen exogenen Induktor in den transgenen Organismen. Dabei hat sich in den letzten Jahren das Tetrazyklin-kontrollierte Genregulationssystem (Tet-System) durchgesetzt. Mit dem Tet-System gelang die Übertragung der stringenten Expressionskontrolle der Regulationselemente des Tetrazyklin-Resistenzoperons von Tn10 in eukaryontische Zellen, wo nun der Tetrazyklin-abhängige Transaktivator tTA durch die Konzentration des Induktors Doxyzyklin (Dox) die Aktivität des Tetrazyklin-regulierbaren Promotors Ptet graduell über einen Expressionsbereich von 5 Größenordnungen reguliert. In transgenen Mäusen ist dieses Regulationsprinzip bereits in über hundert Fällen erfolgreich zur organ- bzw. zelltypspezifischen Untersuchung von Genfunktionen eingesetzt worden, wobei allerdings in den meisten Fällen die regulierte Überexpression eines Gens oder einer dominant aktiven Mutante verwirklicht wurde. Ziel dieser Arbeit war es eine Methodik zu etablieren, mit der die Funktion eines endogenen Gens unter Verwendung des Tet-System in vivo reversibel und graduell steuerbar ist. Der entscheidende Punkt eines solchen Konzeptes ist es, den chromosomalen Lokus des zu untersuchenden Gens unberührt zu lassen, was ein unbeeinträchtigtes Expressionsmuster im nicht-induzierten Zustand garantiert. Diese Art von Regulation eignet sich besonders für Gene, deren Inaktivierung zu einer kompensatorischen Embryonalentwicklung oder zum embryonalen bzw. frühen postnatalen Tod der Tiere führt. Das im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Gen ist nr1, die essentielle Untereinheit des NMDA-Rezeptors. Der NMDA-Rezeptor ist an den Prozessen der synaptischen Plastizität beteiligt, die in direkten Zusammenhang mit der Lern- und Gedächtnisleistung in Säugern stehen. Im ersten Teil der Arbeit ging es um die Etablierung einer transgenen Mauslinie, in welcher der optimierte reverse Transaktivator rtTA2S-M2 unter der Kontrolle des aCamKII-Promotors synthetisiert wird. Durch die sehr guten Regulationseigenschaften von rtTA2S-M2 in Zellkultur war erwartet worden, in der transgenen Linie die Tet-regulierte Genexpression durch die Verabreichung geringer Mengen Induktor im Trinkwasser im Bereich des Großhirn zu ermöglichen. Die Summe der erzielten Ergebnisse mit mehreren Mauslinien zeigt jedoch, daß die Blut-Hirn-Schranke den Transport von Dox in das Großhirn in der Weise limitiert, daß nur eine partielle Induktion des Tet-System durch die üblichen Applikationsmethoden erreicht wird. Selbst durch die massive Verabreichung des Induktors C4, der in zehnfach geringeren Mengen als Dox die rtTA2S-M2 vermittelte Genexpression maximal aktiviert, konnte keine maximale Expression erreicht werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden verschiedene Strategien zur nichtinvasiven Regulation endogener Genfunktionen evaluiert. Dabei wurde zuerst der Einsatz von Hammerhead-Ribozymen untersucht, welche die NR1 mRNA katalytisch spalten und sie damit inaktivieren. Durch zwei verschiedene Selektionsverfahren konnten Hammerhead-Ribozyme identifiziert werden, die zwar in vitro gute Spaltungsaktivitäten und z. T. neuartigen Bindungseigenschaften an die Substrat-RNA aufwiesen, sich jedoch in einem quantitativen zellulären Testsystem als unwirksam in Bezug auf die Produktion eines NR1-Luziferase-Fusionsproteins herausstellten. Desweiteren kamen RNA-Padlocks zum Einsatz, die durch eine sequenzspezifische Bindung an die mRNA und die Ausbildung eines kovalent verknüpften Ringes um die RNA dessen Translation inhibieren sollen. Doch obwohl hier sehr schnelle Komplexierungskinetiken und stabile Bindungseigenschaften an die Substrat-RNA mit den RNA-Padlocks in vitro erzielt wurden, reichte dies für eine Verhinderung der Synthese des NR1-Luziferase-Fusionsproteins im zellulären Testsystem nicht aus. Zuletzt wurde der Einsatz von synthetischen Transkriptionsfaktoren mit Zinkfinger-DNA-Bindungsdomänen untersucht. Durch die Fusion von Zinkfingerproteinen (ZIF) mit genomspezifischen Bindungseigenschaften mit einer entsprechenden eukaryontischen Repressionsdomäne sollte die Interferenz mit dem funktionalen Programm des "TATA-losen" NR1 Promotors zur Unterdrückung der Genexpression möglich sein. Dabei konnte ein ZIF-Fusionsprotein mit einer Repressionsdomäne des Transkriptionsfaktors REST identifiziert werden (ZIF/REST 5-6), mit dem die Unterdrückung der Expression des NR1-Promotors in gleichen Maße möglich war wie mit REST selbst, der die Expression dieses Promotor nur in nichtneuroalen Geweben unterbindet.

Translation of abstract (English)

Conditional inactivation of genes is a powerful strategy for the analysis of gene functions in living animals. Ideally, tissue specific, graded and reversible regulation of the activity of genes with an exogenously provided, otherwise inert, inducing agent would help to determine the role of genes in physiological functions in complex organisms. For this purpose the tetracycline controlled gene expression system (tet system), which is based on the regulatory elements of the bacterial tetracycline resistance operon Tn10, is the method of choice. Here, the tetracycline controlled mammalian transactivator tTA controls specifically the activity of the tetracycline regulated promoter Ptet . The activity of Ptet can be regulated over a range of 5 orders of magnitude, dependent on the concentration of the inducer doxycycline (dox). In transgenic mice, the tet system has been so far successfully applied in over 100 cases of organ and tissue specific expression of transgenes. The aim of my work was to generate a system for reversible and graded inhibition of any endogenous gene of the transgenic animal using the tet system. A salient point of our concept was to keep the chromosomal locus of the target gene untouched, which should warrant a totally unmodified expression pattern of the gene under study both in embryonic development and in adulthood. This strategy would be especially useful for genes, where the inactivation leads either to compensatory changes of the gene expression pattern during embryonic development or to embryonic or early postnatal lethality of the animals, like the gene of interest chosen in this study, nr1, the essential subunit of the NMDA receptor. The first part of this work describes the characterisation of transgenic mouse lines, expressing the gene of the optimized reverse transactivator rtTA2S-M2 under the control of the aCamKII promoter. Due to its improved regulatory properties demonstrated in tissue culture, rtTA2S-M2 was expected to regulate gene expression in the forebrain of the animals, provided only with low concentration of dox in the drinking water. But the sum of our experiments shows clearly, that the blood brain barrier limits the transport of dox and that only partial activation of tet regulated gene expression can be achieved in animals expressing rtTA2S-M2. Even i.p. administration of large concentrations of C4, a substance shown to maximally induce rtTA2S-M2 driven gene expression at 10 times lower concentration compared to dox, was unable to activate Ptet to full extent. In the second part of my thesis, I evaluated several strategies tailored to interfere with the synthesis of an endogenous gene product. First, I used hammerhead ribozymes, which cleave the NR1 mRNA selectively. I applied two different selection procedures to define hammerhead ribozymes with high in vitro cleavage activities. In one case, novel binding properties of the ribozyme to the target RNA could be identified. Nevertheless, the expression of those ribozymes in a quantitative tissue culture based test system did not reduce expression of a NR1 luciferase fusion protein in the targeted cells. Next, I explored the new concept of RNA padlocks to inactivate NR1 mRNA. In vitro, RNA-Padlocks hybridize specifically to the target mRNA and through a covalent ring closure form a circle around the RNA that should block translation. Despite a very fast complex formation and a stable binding of the RNA-padlocks to the NR1 mRNA in vitro, the synthesis of the NR1-luciferase fusion protein was not affected by RNA-padlocks in cell culture. Finally, I evaluated the use of artificial transcription factors with zinc finger DNA binding domains. These proteins were designed to bind specifically to the NR1-promoter region through the zinc finger domain and should inhibit transcription from the promoter via an appropriate repression domain. Here, I could identify the transcription factor ZIF/REST 5-6, consisting of zinc finger protein combined with the repression domain of the transcription repressor REST, that suppressed the activity of the NR1 promoter in a cellular test system as potently as the mammalian transcriptional repressor REST itself.