German Title: Klonale Heterogenität der endokrinen Therapieresistenz bei Brustkrebs

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Abstract

Breast cancer is the most common malignancy in women worldwide and roughly two-thirds of breast tumors are characterized by estrogen receptor (ER) α expression allowing for a targeted treatment approach by suppressing estrogen signaling. Clinically, suppression of estrogen signaling is achieved by Tamoxifen or Fulvestrant which prevent the receptor’s activation or aromatase inhibitors which prevent the formation of (peripheral) estrogen. Unfortunately, relapses are observed in up to 41% of cases and tumor heterogeneity has recently been implicated in therapeutic resistance. To analyze endocrine therapy resistance on a clonal level, I used a previously developed barcoded in vitro model. There, two endocrine therapy sensitive ER+ breast cancer cell lines had been transduced with a barcode library. These cells had then been rendered resistant to Tamoxifen treatment (TAMR) or long-term estrogen deprivation (LTED), the latter to mimic clinically used aromatase inhibitors. Barcode analysis of complex cell pools suggested that endocrine therapy resistance arose either due to the selection of pre-existing clones or the rewiring of initially treatment-persisting cells. In the next step, I isolated and characterized endocrine therapy sensitive and resistant clones from biological replicates using phenotypic assays, RNA-Sequencing and Mass spectrometry-based (phospho-)proteomics. Phenotypically, endocrine therapy resistant clones showed either weak or strong proliferative capacity. On pathway, transcription factor and kinase activity level, I observed heterogeneity between the cell lines utilized resembling inter-tumor heterogeneity and between endocrine therapy resistant clones isolated from each cell line resembling intra-tumor heterogeneity. Activation of the unfolded protein response (UPR) was a private event, which was only observed in a single TAMR population, and correlated with sensitivity to the proteasome inhibitor Bortezomib. Conversely, TAMR and LTED populations shared the activation of multiple protein kinase C (PKC) isoforms, however to different degrees. Treatment with the pan-PKC inhibitor Sotrastaurin preferentially reduced cellular viability of endocrine therapy resistant populations showing stronger PKC activation. Finally, my in vitro findings were supported by clinical findings from the CPTAC-BRCA cohort. Generally, strong heterogeneity between individual patients was evident on pathway, transcription factor and kinase activity levels. After I had deconvoluted the cohort on a per patient basis, I identified patients with estrogen independent tumors showing UPR and PKC activation, closely resembling my in vitro models. Taken together, in the presented PhD thesis I could identify private and shared clonal endocrine therapy resistance drivers with clinical importance.

Translation of abstract (German)

Brustkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung bei Frauen weltweit. Rund zwei Drittel aller Brusttumore sind durch die Expression des Östrogenrezeptor (ER) α charakterisiert und können gezielt durch die Unterdrückung der Östrogen-Signalübertragung behandelt werden. Klinisch wird dafür die Rezeptoraktivierung durch Tamoxifen oder Fulvestrant blockiert, oder die Bildung von (peripherem) Östrogen wird durch Aromatasehemmer verhindert. Leider erleiden bis zu 41% der Patientinnen ein Rezidiv und Tumorheterogeneität kann die Resistenzentwicklung begünstigen. Um die endokrine Therapieresistenz auf klonaler Ebene zu untersuchen, habe ich zuvor entwickelte in vitro Modelle verwendet. Dort wurden zwei bisher unbehandelte ER+ Brustkrebszelllinien mit einer Barcode-Bibliothek transduziert. Diese Zellen wurden dann mit Tamoxifen oder Östrogenentzug behandelt, sodass die Zelllinien Resistenzen gegen die Tamoxifenbehandlung (TAMR) und den Östrogenentzug (LTED) entwickeln. Der Östrogenentzug in vitro spiegelte die Verwendung von Aromatasehemmern in der Klinik wider. Die Barcodeanalyse der komplexen Zellpools deutete darauf hin, dass Resistenz gegen die endokrine Therapie entweder durch die Selektion bereits vorhandener Klone zustande kam oder, dass Zellen, die ursprünglich die Therapie nur überlebt hatten, weitere Veränderungen zur Therapieresistenz erworben haben. Im nächsten Schritt habe ich aus den komplexen Zellpools einzelne Klone isoliert und charakterisiert. Hierzu habe ich phänotypische Tests, RNA-Sequenzierung und Massenspektrometrie basierte (Phospho-)Proteomik verwendet. Generell beobachtete ich große Unterschiede auf phänotypischer und molekularer Ebene zwischen den verwendeten Zelllinien und einzelnen Klonen, welche von der gleichen therapieresistenten Zelllinie isoliert wurden. Respektiver Weise spiegeln diese Unterschiede Heterogenität zwischen Patientinnen (inter-tumor) und zwischen einzelnen Klonen von der gleichen Patientin (intra-tumor) wider. Lediglich eine einzige TAMR-Population wies eine signifikante Aktivierung der ungefalteten Protein Antwort (UPR) auf. Diese UPR-Aktivierung korrelierte mit einer besonders starken Sensibilität gegenüber dem Proteasom-Inhibitor Bortezomib. Somit stellte die UPR-Aktivierung und Sensibilität gegenüber Bortezomib ein privates Ereignis dar. Andererseits waren mehrere TAMR und LTED-Populationen durch die signifikante Aktivierung verschiedener Isoformen der Proteinkinase C (PKC) charakterisiert. Allerdings war diese Aktivierung unterschiedlich stark ausgeprägt. Die Reduktion der zellulären Viabilität nach Behandlung mit dem PKC Inhibitor Sotrastaurin korrelierte hier mit der Stärke der PKC-Aktivierung in einzelnen therapieresistenten Klonen. Abschließend konnte ich meine in vitro Ergebnisse durch klinische Ergebnisse aus der CPTAC-BRCA Studie unterstützen. Generell konnte ich starke Unterschiede zwischen den einzelnen Patientinnen auf molekularer Ebene sehen. Außerdem identifizierte ich einzelne Patientinnen, deren Tumorwachstum nicht von Östrogen angetrieben wurde, und deren Tumore eine signifikante Aktivierung der UPR und einzelner PKC Isoformen aufwiesen. Dadurch ähnelten diese Patientinnen sehr stark meinen in vitro Resistenz-Modellen. Zusammengefasst konnte ich in meiner Promotion Treiber der endokrinen Therapieresistenz identifizieren, welche entweder privat und auf einzelne Klone beschränkt waren oder zwischen mehreren Klonen geteilt waren. Außerdem waren diese Veränderungen in einzelnen Patientinnen mit Östrogen-unabhängigen Tumoren stark ausgeprägt, was die klinische Relevanz meiner in vitro Ergebnisse unterstreicht.