German Title: Analyse der Wirkung neuroaktiver Peptide auf die Thermoregulation im Hypothalamus der Maus

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Abstract

Keeping balance is essential for the survival of mammals. When facing challenges, these animals rely on a neural system that promptly coordinates physiological and behavioral adaptations that are triggered to maintain homeostasis. In such context, neuroactive peptides, including neuropeptides and some peptide hormones, have been proposed to play an important role in the modulation of neural activity. These molecules have been implicated in the control of several processes, such as sleep, reproduction, and feeding, and are also believed to influence thermoregulation. The mammalian core body temperature (Tcore) is maintained by the thermoregulatory circuitry, which is orchestrated by the preoptic area (POA) of the hypothalamus. Different lines of evidence have suggested a role for neuroactive peptides in thermal balance, especially acting at the POA. Despite this, the molecular mechanisms that modulate Tcore during thermal challenges remain unclear.

Here, to investigate which neuroactive peptides are released at the level of the POA during thermal challenges, an unbiased screening of samples collected in vivo from male mice was performed. For this, first, to enrich neuroactive peptide detection, an optimized protocol was established for the in vivo sampling and the sample preparation for liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC/MS-MS) analysis. Next, the optimized protocol was applied on samples collected from the POA of freely behaving adult male mice during three different types of thermal stimuli. These included the chemogenetic activation of a subpopulation of preoptic thermoregulatory neurons expressing the vesicular transporter VGLUT2 (POAVGLUT2), which induced hypothermia, and the ambient warm and cold temperature stimulation. The results suggested that, in total, peptides deriving from 18 neuroactive peptide precursors were detected to be differentially released at the mouse POA during thermal challenges. Among these precursors and respective peptides, somatostatin and secretogranin 1 were differentially detected in samples collected during the stimulation of POAVGLUT2 neurons compared to the control group. Additionally, in comparison to control conditions, the results suggest a differential release of peptides from the precursors of orexins, nociceptin, and nucleobindin 1 in warm-exposed mice, as well as, thyrotropin-releasing hormone (TRH), and diazepam binding inhibitor (DBI) in animals peripherally stimulated with cold. Moreover, the verification of the unbiased screening focused on two candidates, orexin and adiponectin. For both, in vivo samples collected either during warm or cold peripheral stimulation were evaluated with ELISA. In addition, further experiments investigated a potential role of orexins in thermoregulation, by focusing on the POA distribution of orexin receptor 2, the influence of orexin-A on preoptic neurons, and the injection of orexin receptor antagonists into the POA. Results of these experiments may have provided further evidence for the engagement of pro-orexin derived peptides in Tcore control. Additional studies are required to define these and the other peptides as modulators of preoptic thermoregulation. Nonetheless, the list of candidates of thermoregulatory peptides provided by this thesis could contribute to a better comprehension of the molecular control of POA during adaptation to thermal challenges. Given the vital importance of maintaining the Tcore in mammals, such candidates could potentially also be implicated in health and disease.

Translation of abstract (German)

Den Organismus in Balance/Homöostase zu halten, ist für Säugetiere überlebenswichtig. Wenn sie mit Herausforderungen konfrontiert werden, verlassen sich diese Tiere auf ein neuronales System, das physiologische und verhaltensbezogene Anpassungen, die zur Aufrechterhaltung der Homöostase aktiviert werden, umgehend koordiniert. In diesem Zusammenhang wurde vermutet, dass neuroaktive Peptide, darunter Neuropeptide und einige Peptidhormone, eine wichtige Rolle bei der Modulation der neuronalen Aktivität spielen. Diese Moleküle werden mit der Steuerung verschiedener Prozesse wie Schlaf, Fortpflanzung und Nahrungsaufnahme in Verbindung gebracht, und es wird angenommen, dass sie auch die Thermoregulation beeinflussen. Die Körperkerntemperatur (Tcore) von Säugetieren wird durch den thermoregulatorischen Kreislauf aufrechterhalten, der vom präoptischen Areal (POA) des Hypothalamus orchestriert wird. Verschiedene Hinweise deuten auf eine Rolle neuroaktiver Peptide im Wärmehaushalt hin, die insbesondere in der POA wirken. Dennoch sind die molekularen Mechanismen, die Tcore bei thermischen Herausforderungen modulieren, nach wie vor unklar. Um zu untersuchen, welche neuroaktiven Peptide bei thermischen Herausforderungen auf der Ebene der POA freigesetzt werden, wurde ein unvoreingenommene Untersuchung von Proben durchgeführt, die in vivo von männlichen Mäusen gesammelt wurden. Zunächst wurde ein optimiertes Protokoll für die in vivo Probenentnahme und die Probenvorbereitung für die Flüssigchromatographie und Tandem-Massenspektrometrie (LC/MS-MS) erstellt, wodurch die Detektion neuroaktiver Peptide verbessert werden konnte. Anschließend wurde das optimierte Protokoll an Proben angewandt, die während dreier verschiedener Arten von thermischen Reizen aus der POA von frei agierenden männlichen Mäuse entnommen wurden. Dazu gehörte die chemogenetische Aktivierung einer Subpopulation von präoptischen thermoregulatorischen Neuronen, die den vesikulären Transporter VGLUT2 (POAVGLUT2) exprimieren, was eine Hypothermie auslöste, sowie die Stimulation durch warme und kalte Umgebungstemperaturen. In den Untersuchungen konnten insgesamt Peptide aus 18 neuroaktiven Peptidvorläufern nachgewiesen werden, die bei thermischen Herausforderungen in der POA der Maus unterschiedlich freigesetzt werden. In Proben, die während der Stimulation von POAVGLUT2-Neuronen gesammelt wurden, wurden im Vergleich zur Kontrollgruppe Somatostatin und Sekretogranin 1 nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen im Vergleich zu den Kontrollbedingungen eine differentielle Freisetzung von Peptiden aus den Vorläufern von Orexinen, Nozizeptin und Nukleobindin 1 bei wärmeexponierten Mäusen, sowie von Adiponectin, Thyrotropin-Releasing-Hormon (TRH) und Diazepam-Bindungsinhibitor (DBI) bei peripher mit Kälte stimulierten Tieren. Im weiteren Verlauf lag der Fokus auf zwei Kandidaten des Screenings, Orexin und Adiponectin. Für beide wurden in vivo Proben, die entweder während einer warmen oder kalten peripheren Stimulation gesammelt wurden, mit ELISA ausgewertet. In weiteren Experimenten wurde außerdem eine potenzielle Rolle der Orexine bei der Thermoregulation untersucht, wobei der Schwerpunkt auf der Verteilung des Orexin-Rezeptors 2 in der POA, dem Einfluss von Orexin-A auf präoptische Neuronen und der Injektion von Orexin-Rezeptor-Antagonisten in der POA lag. Dies könnte weitere Beweise für die Beteiligung von Pro-Orexin-abgeleiteten Peptiden an der Tcore-Kontrolle liefern. Weitere Studien sind erforderlich, um diese und weitere Peptide als Modulatoren der präoptischen Thermoregulation zu definieren. Nichtsdestotrotz könnte die Liste der in dieser Arbeit vorgestellten Kandidaten für thermoregulatorische Peptide zu einem besseren Verständnis der molekularen Kontrolle der POA während der Anpassung an thermische Herausforderungen beitragen. In Anbetracht der lebenswichtigen Bedeutung der Aufrechterhaltung der Tcore bei Säugetieren könnten diese Kandidaten möglicherweise auch bei Gesundheit und Krankheit eine Rolle spielen.