German Title: Einfluss der Rezeptor-Tyrosin-Kinase EphB2 auf zerebrale Ischämie in Mäusen

Preview

PDF, English (Doctoral thesis) - main document Download (4MB) | Terms of use

Abstract

Stroke is the number two cause of death in the western world and responsible for about 6 billion euros economic costs caused by illness in Germany annually. Approx. 80% of all strokes are ischemic strokes and often develop from a focal cerebral hypoperfusion caused by an occlusion of a major cerebral artery. Despite intensive research, the pathophysiological and regenerative molecular mechanisms of stroke are only partially understood and no causative therapy dealing with the consequences of the ischemic insult is available. The blood-brain barrier (BBB) is a structure built up by endothelial cells, astrocytes and perizytes. It separates the brain from the periphery while still allowing essential metabolites to cross. During cerebral ischemia transendothelial connections are degraded and the BBB permeability increases. This eventually causes vasogenic edema formation. The vessel occlusion-induced local hypoperfusion unleashes a series of events called ischemic cascade. Within minutes, hypoxia- and anoxia-induced intracellular mechanisms lead to excitotoxicity, a process which describes neuronal cell death induction caused by overstimulation of ionotropic glutamate receptors, such as NMDA receptors. Overactivation of NMDA receptors leads to massive Ca2+ influx into neurons and triggers signaling cascades, which among others cause mitochondrial dysfunction and eventually cell death. Among others, the receptor tyrosine kinase EphB2 interacts with the NMDA receptor and regulates NMDA receptor functions which lead to increased Ca2+ influx through the NMDA receptor in the neuron. The EphB/ephrin-B system is a receptor/ligand system, in which both, receptor and ligands are membrane-bound requiring direct cell-to-cell contact in order to induce signaling processes. Additionally, it had been shown that interaction of monocytic EphB2 with endothelial ephrin-B ligands influences transendothelial migration and induces a pro-inflammatory phenotype in endothelial cells. Therefore, this study aims to unravel the involvement of EphB2/ephrin-B signaling during cerebral ischemia. Cerebral ischemia was induced in Ephb2-deficient mice by transient middle cerebral artery occlusion (MCAo) followed by different times of reperfusion. Histological, neurofunctional and transcriptome analyses demonstrated that progression of stroke after 12-48 h of reperfusion is attenuated in Ephb2-deficient mice as compared to wild-type (WT) mice. However, multiple analyses (CT scans, immunofluorescence staining techniques, BBB permeability assays) showed that this observation was not caused by an impact on vascular function. On the other hand, further evaluations based on magnetic resonance imaging revealed that cytotoxic edema formation during the first 6 h after reperfusion was diminished in Ephb2- deficient mice as compared to WT mice pointing towards a neuronal cause. In this context, analysis of brain lysates from WT animals revealed that activation (shown by phosphorylation) of EphB2 was increased after 6 h of reperfusion in the ischemic hemisphere. Next, the influence of EphB2 on neuronal NMDA receptor function was investigated. It turned out that NMDA receptor-mediated Ca2+ transients and mitochondrial membrane depolarization was decreased in Ephb2-deficient neurons as compared to WT neurons. As mitochondrial dysfunction is a hallmark of stroke pathogenesis and a crucial step during induction of excitotoxicity, cell death assays were performed. Widespread exposure to excitotoxic stimuli did not reveal differences in the fraction of dead cells between WT and Ephb2-deficient mice though. Collectively, this is the first study to show that EphB2 is activated within 6 h after stroke and decisively contributes to cytotoxic edema formation while BBB permeability is not influenced by EphB2. In the absence of EphB2, progression of stroke is attenuated with respect to infarct and edema volume as well as neurological function. NMDA receptor-mediated mitochondrial responses are decreased in Ephb2-deficient neurons highlighting its importance for the function of the NMDA receptor. Hence, EphB2-dependent mechanisms contribute to signaling events that eventually worsen stroke progression.

Translation of abstract (German)

Schlaganfälle gehören zu den häufigsten Todesursachen in der westlichen Welt und verursachen in Deutschland jährlich Kosten in Höhe von etwa 6 Milliarden Euro. Etwa 80% aller Schlaganfälle sind ischämische Schlaganfälle und werden meist durch einen Verschluss einer hirnversorgenden Endarterie verursacht. Trotz intensiver Forschungsarbeit sind die molekularen pathophysiologischen Mechanismen des Schlaganfalls nur teilweise aufgeklärt und derzeit ist keine kausale Therapie vorhanden, die die Konsequenzen des ischämischen Insults behandelt. Die Bluthirnschranke (BHS), eine Struktur bestehend aus Endothelzellen, Astrozyten und Perizyten, trennt das Gehirn von der Peripherie, ermöglicht aber den Einstrom von essentiellen Metaboliten in das Gehirn. Während eines Schlaganfalls werden die Verbindungen zwischen den Endothelzellen degradiert, was eine erhöhte Durchlässigkeit der BHS zur Folge hat und schließlich durch Wassereinstrom ein vasogenes Ödem induziert. Die durch den Gefäßverschluss bedingte lokale Unterversorgung initiiert eine Folge von Ereignissen, die als ischämische Kaskade bekannt ist. Innerhalb weniger Minuten führen durch Hypoxie und Anoxie ausgelöste Mechanismen zu Exzitotoxizität, ein Prozess bei dem neuronaler Zelltod durch Überstimulation von Glutamatrezeptoren auf Neuronen, wie zum Beispiel den ionotropen NMDA-Rezeptor, hervorgerufen wird. Diese Überstimulation bewirkt einen massiven Ca2+-Einstrom und löst weitere Signalkaskaden aus, wie beispielsweise eine Dysfunktion von Mitochondrien. An der Funktion des NMDA-Rezeptors ist u.a. die Rezeptor-Tyrosin-Kinase EphB2 beteiligt und steuert den Ca2+-Einstrom durch den NMDA-Rezeptor in das Neuron. Das EphB/Ephrin-B-System ist ein Rezeptor-/Liganden- System bei dem sowohl Rezeptor als auch Ligand membranständig sind. Für eine Bindung zwischen Rezeptor und Ligand ist demzufolge direkter Zellkontakt erforderlich. So konnte bereits gezeigt werden, dass EphB2 auf Monozyten mit Ephrin-B-Liganden auf Endothelzellen interagiert und dadurch sowohl eine Transmigration der Monozyten durch die Endothelzellschicht ermöglicht als auch den proinflammatorischen Phänotyp von Endothelzellen beeinflusst. Aus diesen Gründen war das Ziel dieser Arbeit, den Einfluss von EphB2/Ephrin-B-Liganden während zerebraler Ischämie zu untersuchen. In Ephb2-defizienten Mäusen wurde durch Okklusion der mittleren zerebralen Hirnarterie (MCAo) zerebrale Ischämie erzeugt, die von einer Reperfusionsphase gefolgt war. Analysen von histologischen Färbungen, neurologischen Funktionen und des Transkriptoms ergaben, dass die Schlaganfallauswirkungen nach 12-48 h Reperfusion in Ephb2-defizienten Mäusen gegenüber Wildtyp (WT) Mäusen abgeschwächt waren. Wie multiple Untersuchungen (u.a. CT-Scans, Immunfluoreszenzfärbungen, BHS-Permeabilität-Assays) zeigten, war eine Störung der vaskulären Funktion nicht die Ursache dieser Beobachtung. Weitere Untersuchungen auf Basis von MRT-Scans ergaben jedoch, dass sich in Ephb2- defizienten Mäusen innerhalb der ersten 6 h nach Reperfusion ein zytotoxisch bedingtes Ödem geringer ausprägte und auf eine neuronale Ursache hinwies. Analysen von Hirnlysaten aus WT Mäusen zeigten in diesem Zusammenhang, dass EphB2 nach 6 h Reperfusion in der ischämischen Hemisphäre aktiviert wird (gemessen anhand des Phosphorylierungsstatus). Als nächstes wurde der Einfluss von EphB2 auf die NMDARezeptor- Funktion getestet. Es stellte sich heraus, dass in Ephb2-defizienten Neuronen NMDA-Rezeptor-abhängiger Ca2+-Einstrom in Mitochondrien sowie NMDA-Rezeptor-abhängige mitochondriale Membrandepolarisierung gegenüber WT Neuronen vermindert waren. Da mitochondriale Dysfunktionen ein entscheidendes Merkmal der Schlaganfallpathogenese ist und einen Mechanismus im Rahmen der Induktion von Exzitotoxizität darstellt, wurde eine Zelltodanalyse durchgeführt. Breitgefächerte Exzitotoxizität führte jedoch nicht zu unterschiedlichen Anteilen toter Zellen zwischen WT und Ephb2-defizienter Neuronen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit erstmals, dass EphB2 innerhalb von 6 h nach Schlaganfall aktiviert wird und entscheidend zur zytotoxischen Ödembildung beiträgt, wohingegen die BHS-Permeabilität nicht durch EphB2 verändert wird. Bei Abwesenheit von EphB2 sind die Auswirkungen eines Schlaganfalls wir Infarkt- und Ödemvolumen oder neurologische Defizite abgeschwächt. In Ephb2-defizienten Neuronen sind NMDA-Rezeptor-gesteuerte mitochondriale Antworten vermindert, was die Wichtigkeit von EphB2 in Bezug auf die NMDA-Rezeptor-Funktion betont. EphB2-gesteuerte Mechanismen tragen demnach zu Signalprozessen bei, die schließlich zum neuronalen Zelltod führen.