German Title: Kooperation von Zellen des angeborenen Immunsystems bei einer Hepatitis C Virus Infektion

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Abstract

Induction of an innate immune response requires recognition of pathogen associated molecular patterns (PAMPs) by pattern recognition receptors (PRRs). However, pathogens like the Hepatitis C virus (HCV) have evolved mechanisms to evade innate immune responses in infected host cells. HCV specifically infects hepatocytes, thus specialized immune cells are not affected by the immune modulatory mechanisms exerted by HCV. Indeed, it was observed that plasmacytoid dendritic cells (pDCs) recognize HCV infected cells and respond with IFNα secretion. In this study the response of innate immune cells against HCV was further analyzed in a co-culture of HCV subgenomic replicon (SGR) cells and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). It was confirmed that IFNα is produced by pDCs in this co-culture and it was shown that the secreted IFNα inhibits viral replication. Subsequently, it was demonstrated that pDC activation is triggered by viral RNA and that recognition of viral RNA in pDCs is dependent on TLR7. The transfer of viral RNA from infected cells into pDCs required cell-cell contacts. Following the characterization of the pDC response, a Luminex assay was performed to detect further cytokines and chemokines secreted by PBMCs in response to HCV SGR cells. As secretion of IFNγ was detected, NK cells were assumed to be activated. NK cell depletion from PBMCs resulted in loss of IFNγ, proving that NK cells are the source of IFNγ. Moreover, it was observed that also monocytes play a role in the anti-viral response. Flow cytometry and ImageStream analysis revealed an uptake of particles from HCV SGR cells by monocytes. The particles were found to be apoptotic vesicles, as PBMCs induced apoptosis in HCV SGR cells via tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) expression on NK cells. However, interactions between pDCs, NK cells and monocytes were required for efficient clearance of HCV SGR cells, as purified immune cells alone did not kill HCV SGR cells. Although expression of TRAIL receptors was comparable in HCV SGR cells and Huh-7 control cells, HCV activated PBMCs specifically targeted HCV SGR cells without killing Huh-7 control cells. The specific kill of HCV SGR cells was finally explained by the observation that HCV SGR cells are sensitive towards TRAIL induced apoptosis. In summary it was shown that next to pDCs also NK cells and monocytes contribute to the response against HCV. Most importantly, the results underline the necessity of the interplay and mutual activation of different innate immune cells to initiate an efficient, rapid and specific response against HCV infected cells.

Translation of abstract (German)

Eine Antwort des angeborenen Immunsystems wird durch die Erkennung von Pathogen-assoziierten molekularen Mustern durch Mustererkennungsrezeptoren ausgelöst. Pathogene wie das Hepatitis C Virus (HCV) verfügen jedoch über Mechanismen, die die angeborene Immunantwort in infizierten Zellen zu unterdrücken. HCV infiziert spezifisch Leberzellen, wodurch spezialisierte Immunzellen nicht von den immun-modulatorischen Mechanismen des Virus betroffen sind. Tatsächlich wurde beobachtet, dass plasmazytoide Dendritische Zellen (pDC) HCV infizierte Zellen erkennen und IFNα sekretieren. In dieser Arbeit wurde die Antwort des angeborenen Immunsytems gegen das HCV näher untersucht, indem HCV subgenomische Replikonzellen (HCV SGR Zellen) mit Immunzellen aus dem Blut (PBMCs) ko-kultiviert wurden. Es wurde bestätigt, dass in der Ko-Kultur von PBMCs mit HCV SGR Zellen IFNα von pDCs produziert wird und dass IFNα die virale Replikation inhibiert. Anschließend wurde gezeigt, dass die pDC Aktivierung durch virale RNA ausgelöst wird und dass diese durch TLR7 in pDCs erkannt wird. Der Transfer viraler RNA von infizierten Hepatozyten in pDCs erforderte direkten Zell-Zell Kontakt. Nachdem die pDC Antwort charakterisiert wurde, wurde eine Luminex Messung durchgeführt, um weitere Zytokine und Chemokine, die in dieser Ko-Kultur von PBMCs sekretiert werden, zu entschlüsseln. Die Detektion von IFNγ lieferte einen Hinweis, dass NK Zellen an der Immunantwort gegen HCV beteiligt sind. Dies wurde bestätigt durch Depletion von NK Zellen aus PBMCs: unter diesen Bedingungen konnte kein IFNγ mehr gemessen werden. Darüber hinaus wurde entdeckt, dass auch Monozyten in der anti-viralen Immunantwort eine Rolle spielen. Durchflusszytometrie und ImageStream Analysen zeigten eine Aufnahme von Partikeln von HCV SGR Zellen durch Monozyten. Diese Partikel wurden als apoptotische Vesikel identifiziert, da PBMCs durch Expression von TRAIL auf NK Zellen Apoptose in HCV SGR Zellen auslösten. Für eine effiziente Eliminierung von HCV SGR Zellen waren jedoch Interaktionen zwischen pDCs, NK Zellen und Monozyten nötig, da isolierte Immunzellen HCV SGR Zellen nicht abtöten konnten. Obwohl die Expression der TRAIL Rezeptoren in HCV SGR Zellen und Huh-7 Kontrollzellen vergleichbar war, töteten durch HCV aktivierte PBMCs ausschließlich HCV SGR Zellen, nicht aber Huh-7 Kontrollzellen. Diese Spezifität konnte letztlich dadurch erklärt werden, dass HCV SGR Zellen per se sensibler gegenüber TRAIL induzierter Apoptose waren. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass neben pDCs auch NK Zellen und Monozyten zur Immunantwort gegen HCV beitragen. Die wichtigsten Erkenntnisse sind die Beobachtungen, dass nur durch ein Zusammenspiel und gegenseitige Aktivierung von verschiedenen Zellen des angeborenen Immunsystems eine effiziente, schnelle und spezifische Immunantwort gegen HCV infizierte Zellen ausgelöst wird.