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Abstract

The antibiotic roseoflavin (RoF) is the only known natural riboflavin (vitamin B2) analogue and is active against gram-positive bacteria. RoF is produced by Streptomyces cinnabarinus (S. cinnabarinus) and Streptomyces davawensis (S. davawensis) and can be considered to be an “antivitamin”. In RoF biosynthesis one of the methyl groups of the predicted precursor riboflavin undergoes a site-specific replacement by a dimethyl amino group whereby 8-demethyl-8-amino-riboflavin (AF) was postulated to be an intermediate. The first discovered enzyme of roseoflavin biosynthesis was the S-adenosyl methionine (SAM) dependent dimethyltransferase RosA which converts AF to RoF. Subsequent systematic gene deletion experiments carried out in the RoF-producer S. davawensis suggested that a single enzyme (RosB) is responsible for the formation of AF. However, when recombinant RosB was tested in an assay mixture containing riboflavin-5’-phosphate (RP) the formation of the predicted final reaction product AF was not observed. Instead the compound 8-demethyl-8-formyl-riboflavin-5’-phosphate (HOC-RP) was detected, probably an intermediate of the RosB reaction. How the formyl-group of HOC-RP was replaced by an amino group to give AF or 8-demethyl-8-amino-riboflavin-5’-phosphate (AFP) remained unclear. The present work was initiated to investigate the predicted oxidation of HOC-RP to 8-demethyl-8-carboxyl-riboflavin-5’-phosphate (HOOC-RP), to identify the amino group donor of the RosB reaction and to shed light on the reaction mechanism of the multi-step enzyme RosB. It was found that RosB accepts only RP as a substrate and not riboflavin (RF). RosB activity depends on the presence of O2, thiamine and the amino group donor glutamate. HOOC-RP was found to be an (additional) intermediate of the RosB reaction. The crystal structure of RosB was solved with bound AFP (1.7 Å) and HOC-RP (2.0 Å). RosB is composed of four flavodoxin-like subunits which have been upgraded with specific extensions and a unique C-terminal arm. Structure-based active site analysis was complemented by mutational and isotope-based mass-spectrometric data to propose an enzymatic mechanism. The present work also shows that the RoF biosynthetic pathway still has not been completely resolved. RosB releases AFP, yet the substrate for the subsequent RosA reaction is AF. Consequently, a phosphatase must be present which has not yet been identified.

Translation of abstract (German)

Roseoflavin ist das einzig bekannte Vitamin B2-Analogon, welches eine antibiotische Wirkung gegen grampositive Bakterien aufweist. Es wird von Streptomyces cinnabarinus und Streptomyces davawensis (S. davawensis) produziert und kann als „Antivitamin“ betrachtet werden. Im Verlauf der Roseoflavinbiosynthese wird spezifisch eine der beiden Methylgruppen des wahrscheinlichen Vorläufermoleküls Riboflavin durch eine Dimethylaminogruppe substituiert. Es wurde angenommen, dass 8-Demethyl-8-amino-riboflavin (AF) ein Zwischenprodukt dieser Synthese sei. Als erstes Enzym der Roseoflavinbiosynthese wurde RosA beschrieben, eine Dimethyltransferase, welche mithilfe von S-Adenosylmethionin (SAM) aus AF RoF bildet. Die Ergebnisse der systematischen Gendeletionsexperimente im RoF-Produzenten S. davawensis zeigten, dass sehr wahrscheinlich nur ein Enzym (RosB) für die AF-Bildung verantwortlich ist. Als jedoch RosB mit Riboflavin-5‘-Phosphat (RP) in vitro getestet wurde, konnte die Synthese von AF nicht beobachtet werden. Anstelle von AF wurde 8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5’-phosphat (HOC-RP) gefunden, eine wahrscheinliche Zwischenstufe der RosB-Reaktion. Wie die Formylgruppe von HOC-RP gegen eine Aminogruppe ausgetauscht wird um AF (oder 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5’-phosphat, AFP) zu bilden blieb unklar. Die vorliegende Arbeit wurde initiiert, um die wahrscheinliche Oxidation von HOC-RP zu 8-Demethyl-8-carboxy-riboflavin-5’-phosphat (HOOC-RP) zu untersuchen, den Amino-gruppendonor der RosB-Reaktion zu identifizieren und den Reaktionsmechanismus des mehrstufigen Enzyms RosB zu analysieren. RosB akzeptiert nur RP als Substrat und nicht RF. RosB benötigt Sauerstoff, den Aminogruppendonor Glutamat und Thiamin, um den Austausch der Methylgruppe gegen eine Aminogruppe zu katalysieren. HOOC-RP wurde als weiteres Intermediat der RosB-Reaktion identifiziert. Die Kristallstruktur von RosB gebunden an die Flavine AFP (1,7 Å) und HOC-RP (2,0 Å) wurde gelöst. RosB besteht aus vier flavodoxinähnlichen Untereinheiten die mit spezifischen Domänen und einem einzigartigen C-terminalem Arm ausgestattet worden sind. Die strukturelle Analyse des aktiven Zentrums von RosB wurde durch Mutagenesestudien und isotopenbasierten massenspektrometrischen Untersuchungen ergänzt. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein Reaktionsmechanismus erarbeitet. Die vorliegende Studie zeigt auch, dass die Roseoflavinbiosynthese noch nicht vollständig verstanden wird. RosB setzt AFP frei, jedoch ist das Substrat für die nachfolgende Reaktion von RosA AF. Demnach muss eine (noch unbekannte) Phosphataseaktivität in S. davawensis vorhanden sein, die die Dephosphorylierung von AFP zu AF katalysiert.