German Title: Das Spektrum des nukleozytoplasmatische Transportsystem and zellspezifische Variationen der Kernpore

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Abstract

The main function of the nuclear pore complex (NPC) is to facilitate and regulate the transport between the cytosol and the nucleus but NPCs are also involved in various other cellular functions, including regulation of gene expression, translational control, signal transduction and cell differentiation. The nucleocytoplasmic transport system is composed of the NPC, that forms a large aqueous channel lined with FG-repeats containing nucleoporins (FG-Nups). FG-Nups constitute a permeability barrier, which prevents the passage of the majority of all proteins. Nuclear transport receptors (NTRs, also called importins, exportins or karyopherins) specifically recognize localization signals of cargo molecules and facilitate their passage through the central channel by transiently interacting with FG-Nups. Classical methods such as affinity purification or measurement of dissociation constants are not well-suited to globally identify NTR-cargo interactions because they are of a very transient nature, the spectrum of recognized cargos is huge and their dynamic concentration range comprises orders of magnitude. The exact cargo spectrum of the majority of NTRs, their specificity and even the extent to which active nucleocytoplasmic transport contributes to protein localization thus remains uncertain. To systematically map cargo-NTR relationships in an unbiased way in situ, I used proximity labeling mass spectrometry based on the so-called BioID system. I systematically fused BirA to various NTRs and other factors involved in nucleocytoplasmic transport. I found that at least one third of the human proteome is subject to active nuclear transport. I characterized the specific cargo spectrum of several NTRs and can thus estimate their specificity or overlap with other transport pathways. I identified the responsible transport pathways of various key protein complexes and demonstrated that those and components of pathways tend to be transported by related NTRs. The identification of the exact biotinylation sites provided evidence for the relevant interaction surfaces and sheds light in direct versus piggyback transport mechanisms. To understand the compositional changes, potentially affecting the nucleocytoplasmic transport, within the NPC and NTR system better, I investigated them during development and within different cell types in Drosophila and Zebrafish. For the NPC only Nups, exposed to the environment, showed significant changes. The abundance changes of the NTRs were more dynamic and indicated a more flexible adaptation to changing circumstances.

Translation of abstract (German)

Die Hauptfunktion der Kernporen (NPC) besteht darin, den Transport zwischen dem Zytoplasms und dem Zellkern zu erleichtern und zu regulieren, aber NPCs sind auch an verschiedenen anderen zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich der Regulations von Transkription und Translation, Signaltransduktion und Zelldifferenzierung. Das nukleozytoplasmatische Transportsystem besteht aus dem NPC, der einen großen wässrigen Kanal bildet, der mit Nukleoporinen mit FG-Wiederholungen (FG-Nups) ausgekleidet ist. FG-Nups bilden eine Permeabilitätsbarriere, die die Passage der meisten Proteine verhindert. Kerntransportrezeptoren (NTRs, auch Importine, Exportine oder Karyopherine genannt) erkennen spezifisch Lokalisierungssignale und erleichtern den Durchgang von Cargos durch transiente Interaktionen mit FG-Nups im zentralen Kanal. Klassische Methoden wie die Affinitätsreinigung oder die Messung von Dissoziationskonstanten sind ungeeignet, um NTR-Cargo-Wechselwirkungen global zu identifizieren, da sie sehr transient sind, das Spektrum unterschiedlicher Cargos riesig ist und ihr Konzentrationsbereich mehrere Größenordnungen umfasst. Das genaue Cargospektrum der meisten NTRs, ihre Spezifität und sogar das Ausmaß, in dem der aktive nucleozytoplasmatische Transport zur Proteinlokalisierung beiträgt, bleibt somit ungewiss. Um die NTR-Cargo-Beziehungen systematisch in situ abzubilden, habe ich das so genannten BioID-System verwendet in Kombination mit Massenspektrometrie. Ich fusionierte BirA mit verschiedene NTRs und andere Faktoren, die am nukleozytoplasmatischen Transport beteiligt sind. Ich habe heraus gefunden, dass mindestens ein Drittel des menschlichen Proteoms einem aktiven Kerntransport unterliegt. Ich charakterisierte das spezifische Cargospektrum mehrerer NTRs und kann damit deren Spezifität oder Überlappung mit anderen Transportwegen abschätzen. Ich identifizierte die verantwortlichen Transportwege von verschiedenen Schlüsselproteinkomplexen und zeigte, dass diese und Komponenten von Signalwegen durch verwandte NTRs transportiert werden. Die Identifizierung der genauen Biotinylierungsstellen lieferte Hinweise auf relevante Wechselwirkungsoberflächen und direkter Transport oder indirekten Transport via Huckepack. Um die Veränderungen der Zusammensetzung zu verstehen, die möglicherweise den nukleozyto-plasmatischen Transport innerhalb des NPC und NTR-Systems beeinflussen, untersuchte ich diese während der Entwicklung und in verschiedenen Zelltypen in Drosophila und Zebrafisch. Für den NPC zeigten nur Nups, die der Umwelt ausgesetzt waren, signifikante Veränderungen. Die Änderungen der NTRs war dynamischer und zeigte eine flexiblere Anpassung an sich verändernte Umstände.