German Title: EMBRYONALE FUNKTIONEN DER REPROGRAMMIERUNGS-MUTANTEN MIWI2, MILI UND DNMT3L BEEINFLUSSEN DEN ERHALT DER ADULTEN MÄNNLICHE KEIMBAHN

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Abstract

Miwi2 and Mili are involved in piRNA production and transposon silencing in fetal gonads. It is known that the loss of Miwi2 leads to a complete exhaustion of germline in male mice. Whether the absence of Mili results in the same phenotype, has not been established yet. In this study we show that Mili is also required for germ cell maintenance, but presents a much weaker phenotype than Miwi2 with only a partial loss of the germ line observed in aged mice. The difference between the two mutant phenotypes could be explained by the fact that in Mili deficient fetal testes a small amount of piRNAs is produced that can mount a residual defense against transposable elements as determined by bisulfite sequencing data. We have determined that piRNAs made in the absence of Mili make up a small pool of piRNAs that are also present in the wild type mice. Mili mutant piRNAs are mainly primary in nature and are most likely bound by Miwi2 since Miwi2 partially retains its nuclear localization in the absence of Mili in mouse fetal gonadocytes. In summary, a primary piRNA biogenesis pathways exist in mouse in the absence of Mili that contribute to both germ line reprogramming and maintenance. Miwi2 and Dnmt3L are involved in de novo DNA methylation in fetal gonads. Miwi2 and Dnmt3L mutant mice exhibit a depletion of germline with age. Dnmt3L mutant mice completely lose germ cells within a two-month period, while Miwi2 mutant mice exhibit Sertoli-only phenotype at nine-month of age. Nonetheless, the phenotype of both reprogramming mutants indicates Miwi2 and Dnmt3L’s possible role in germline maintenance. In this study we have shown that the main role of Miwi2 and Dnmt3L in establishing and maintaining the population of undifferentiated spermatogonia precursor cell population in the adult is executed through their role in reprogramming fetal gonadocytes. We have observed that even though Miwi2- and Dnmt3L-deficient spermatogonial precursor cells exhibit transposon de-repression, no apparent loss these cells can be associated with DNA damage. We hypothesize that actively transcribed TE containing locus generates hybrid transcripts triggering abnormal gene expression program in spermatogonia stem cells, which leads to a great reduction in the numbers of actual GFRa1pos stem cells observed n Miwi2 and Dnmt3L mutant testis. Overall, this study shows the importance of germ cell reprograming in establishing a healthy, functional stem cell population in the adult tissue.

Translation of abstract (German)

Miwi2 und Mili sind in der piRNA Produktion und der Stilllegung von Transposons in fötalen Hoden involviert. Es ist bereits bekannt, dass der Verlust von Miwi2 zu einem Totalverlust der Keimbahnzell en in männlichen Mäusen führt. Ob jedoch der Verlust von Mili zu einem ähnlichen Phänotyp führt, wurde bisher noch nicht erforscht. In dieser Studie zeigen wir, dass Mili ebenfalls für die Keimzell-Erhaltung benötigt wird, jedoch einen schwächeren Phänotypals Miwi2 zeigt, der sich in teilweisem Verlust von Keimzellen in gealterten Mäusen manifestiert. Der Unterschied zwischen den Phänotypen der zwei Mutanten konnte durch die Produktion von kleinen Mengen piRNAs in Mili-defizienten fötalen Hoden erklärt werden. Diese ermöglichen eine Restantwort auf transponierbare Elemente, welche durch Bisulfit-Sequenzierungs Daten demonstriert wird. Wir beschreiben, dass piRNAs, die in Abwesenheit von Mili produziert werden, eine kleine Gruppe piRNAs darstellen, die auch in Wildtyp-Mäusen präsent ist. Diese piRNAs sind hauptsächlich primärer Natur und sehr wahrscheinlich an Miwi2 gebunden, da Miwi2 trotz Abwesenheit von Mili auch weiterhin teilweise eine nukleare Lokalisation in fötalen Hoden aufweist. Zusammenfassend legtdiese Studie nahe, dass ein tertiärer piRNA Biogeneseweg in Maushoden existiert, der zu Keimzell-Reprogrammierung und -Erhaltung beiträgt. Miwi2 und Dnmt3L sind in der de novo DNA Methylierung DNA in fötalen Hoden involviert. Männliche Miwi2 und Dnmt3L knockout Mäuse zeigen einen Verlust der männlichen Keimbahn im Alter. Die Dnmt3L knockout Mäuse verlieren die Keimzellen dabei innerhalb von zwei Monaten, während die Miwi2 Mutanten mit neun Monaten ein Sertoli-only Syndrom aufweisen. Beide Phänotypen weisen daher auf eine Funktion von Miwi2 und Dnmt3L in der Erhaltung der Keimbahn hin. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die primäre Rolle von Miwi2 und Dnmt3L in der Etablierung und Erhaltung der adulten Population undifferenzierter spermatogonialer Stammzellen in ihrer Funktion während der fötalen Reprogrammierung von Gonadozy ten begründet liegt. Wir konnten demonstrieren, dass trotz deutlicher Transposon-Aktivierung in Miwi2- und Dnmt3L-defizienten Spermatogonien Vorläuferzellen der Verlust dieser Zellen nicht mit DNA Schäden korreliert werden kann. Wir stellen daher die Hypothese auf, dass ein aktiv transkribierter Transposonlocus zur Expression von hybriden Transkripten führt, die ein verändertes Genexpressions-Programm in spermatogonialen Stammzellen induzieren. Dieses wiederum würde zu einer deutlichen Reduktion an undifferenzierten GFRa1pos Stammzellen im Hoden führen, wie wir sie in Miwi2 und Dnmt3L knockout Hoden beobachten. Zusammengenommen zeigt diese Studie die Bedeutung der fötalen Keimzellen-Reprogrammierung für die Etablierung einer funktionellen Stammzellpopulation in adulten Gewebe.