English Title: The role of the transcription factor NFAT5 during hypertension-induced arterial remodelling processes

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Abstract

Bluthochdruck gilt als Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen wie Schlaganfall oder Herzinfarkt. Der erhöhte transmurale Druck, der auf die arteriellen Gefäße wirkt, resultiert nach dem Gesetz von Laplace in einer erhöhten tangentialen Wandspannung und führt zu pathologischen Veränderungen in der arteriellen Gefaßwand. Infolgedessen erhöht sich die Gefäßsteifigkeit, die - über einen Anstieg des peripheren Widerstands und somit einer Nachlasterhöhung für das Herz - die Progression der Hypertonie weiter fördert. Durch einen Anstieg der Wandspannung verlieren glatte Gefäßmuskelzellen ihren kontraktilen, ruhenden Phänotyp, der durch die Expression von Genprodukten des kontraktilen Apparates (z.B. SM-MHC, SMalphaA) gekennzeichnet ist. Gleichzeitig erhöht sich die Proliferation und Migrationsaktivität der glatten Gefäßmuskelzellen einhergehend mit einer gesteigerten Synthese von Matrixmolelekülen (z.B. Kollagen I) und Matrixmetalloproteinasen wie MMP-2, was sich auf die Architektur und Komposition der Extrazellulärmatrix auswirkt. In diesem Zusammenhang wurde beschrieben, dass der Transkriptionsfaktor NFAT5 (nuclear factor of activated T-cells 5) diesen aktivierten, synthetischen glattmuskulären Phänotyp fördert, indem er beispielsweise eine verstärkte Genexpression des Matrixmoleküls Tenascin C (TNC) stimuliert, welches die Proliferation der Zellen fördert. Basierend auf diesen Beobachtungen diente diese Arbeit der Aufklärung von biomechanisch induzierten Mechanismen, die zur Aktivierung von NFAT5 führen. Darüber hinaus sollte die funktionelle Rolle von NFAT5 während Bluthochdruck-induzierter Remodellierungsprozesse in vitro und in vivo untersucht werden. Die biomechanische Dehnung glatter Gefäßmuskelzellen aus Arterien in vitro resultierte sowohl in einer erhöhten Proteinsynthese als auch in einem verstärkten Kernimport von NFAT5, das nach Bindung an die DNA die Genexpression von Actin-beta-like-protein 2 (ACTBL2) induzierte. ACTBL2 kodiert dabei für die Aktin-Isoform Kappa-Aktin, die funktionell einen kritischen Beitrag zur gerichteten glattmuskulären Migration lieferte. Ferner konnte erstmalig gezeigt werden, dass eine divergente Regulation der NFAT5-Isoformen A und C nach Dehnung auftritt. Die Überexpression der entsprechenden Isoformen führte dazu, dass die nukleäre Akkumulation von NFAT5c, das in ruhenden Zellen sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern vorliegt, durch biomechanische Dehnung verstärkt wird. Im Gegensatz dazu war NFAT5a sowohl in ruhenden als auch in gedehnten Zellen ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert. Der Einfluss von posttranslationalen Proteinmodifkationen auf die Kerntranslokation von NFAT5 wurde mithilfe der zielgerichteten Mutation von spezifischen Aminosäuren im NFAT5c-Protein bzw. durch die Inhibition bestimmter Signalwege untersucht. So war eine u.a. durch die Kinase c-Abl vermittelte Phosphorylierung von Tyrosin-143 ebenso wie eine Palmitoylierung durch Palmitoyltransferasen der CPT1-Familie (Carnitin-Palmitoyltransferasen) essentiell für den dehnungsinduzierten Kernimport von NFAT5. Im Gegensatz dazu schien die Kerntranslokation durch eine Phosphorylierung an Serin-1197 inhibiert und somit kontrolliert zu werden. Durch die Verwendung von induzierbaren, glattmuskulär NFAT5-defizienten Mäusen war es möglich, die funktionelle Rolle von NFAT5 in vivo zu untersuchen. Bei der Hypoxie-induzierten pulmonalen Hypertonie resultierte ein Verlust von glattmuskulärem NFAT5 in einer verminderten Rechtsherzhypertrophie, einer geringeren medialen Verdickung der kleinen peripheren Lungenarterien sowie einer verminderten Expression der NFAT5-abhängigen Zielgene TNC und Kappa-Aktin. Außerdem führte der Verlust von glattmuskulärem NFAT5 im Rahmen einer experimentell induzierten arteriellen Hypertonie (DOCA/Salz-Modell) zu einer verminderten Proliferation der glatten Gefäßmuskelzellen in den Femoralarterien. Im Rahmen dieser Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor NFAT5 – möglicherweise durch die Regulation der Genexpression von Kappa-Aktin und TNC – eine bisher unbekannte, wichtige Rolle in der Pathogenese von Bluthochdruck-induzierten Gefäßumbauprozessen spielt. Die der dehnungsinduzierten Translokation von NFAT5 in den Zellkern zugrunde liegenden Mechanismen könnten zukünftig als Angriffspunkt zur Entwicklung einer neuartigen Therapie Hypertonie-induzierter arterieller Umbauprozesse genutzt werden.

Translation of abstract (English)

Hypertension is a known risk factor for cardiovascular diseases such as stroke or cardiac infarction. According to the law of Laplace, a rise in transmural pressure acting on the arterial vessel wall causes an increase in wall tension or stress, which may lead to maladaptive remodelling processes in the arterial vessel wall. Consequently, arterial stiffness rises followed by an increase in peripheral resistance and afterload for the heart, hence promoting a further rise in blood pressure. Due to the increase in wall stress, the vascular smooth muscle cells (SMC) lose their so-called contractile resting phenotype, which is characterized by the expression of gene products such as smooth muscle myosin heavy chain (SM-MHC) or smooth muscle alpha actin (SMalphaA). This phenotypic shift enhances the cells’ migratory and proliferative properties accompanied by an increased expression of matrix molecules (e.g. collagen I) and metalloproteinases (MMPs) such as MMP-2, which affect the architecture and composition of the extracellular matrix. In this regard, it has been reported that the transcription factor NFAT5 (nuclear factor of activated T-cells 5) may promote this transition into an active, synthetic SMC phenotype by enhanced transcription of downstream effectors gene products such as that of the matrix molecule tenascin C (TNC), leading to increased SMC migration and mitogenesis. Based on these findings, this work serves to clarify the mechanism(s) underlying biomechanical stretch-induced activation of NFAT5. Additionally, the functional role of NFAT5 during hypertension-induced remodelling processes in vitro and in vivo was investigated in greater detail. Biomechanical stretch of arterial SMCs in vitro led to an increase in protein synthesis as well as to an enhanced nuclear import of NFAT5, which after binding to the DNA further promoted expression of actin-beta-like-protein 2 gene (ACTBL2). ACTBL2 encodes the actin isoform kappa-actin that functionally contributed towards SMC migration. Here, we show for the first time that NFAT5 isoforms A and C are differentially regulated in stretch-stimulated SMCs. Overexpression of the corresponding isoform in vascular SMCs revealed that NFAT5c, which was primarily located in the cytosol and partially in the nucleus of resting cells, increasingly accumulated in the nucleus upon exposure of the cultured SMCs to (cyclic) stretch. In contrast, NFAT5a was detected exclusively in the cytosolic fraction in resting as well as in stretch-stimulated SMCs. The impact of posttranslational protein modification on NFAT5 translocation was studied by site-directed mutagenesis of specific amino acids of the NFAT5c protein or by inhibition of definite signalling molecules. Thus, phosphorylation of tyrosine-143 mediated by kinase c-Abl amongst others as well as palmitoylation through (a) member(s) of the CPT1 (carnithine palmitoyltransferase 1) family was essential for the stretch-induced nuclear import of NFAT5. In contrast, nuclear translocation appeared to be inhibited and thus controlled by phosphorylation of NFAT5c at serine-1197. The use of inducible, SMC-specific NFAT5-deficient mice enabled further investigation into the functional role of NFAT5 in vivo. In hypoxia-induced pulmonary hypertension, the SMC-specific loss of NFAT5 led to reduced right heart hypertrophy, reduced medial thickening of peripheral small lung arteries as well as reduced expression of the NFAT5-dependent genes tenascin C and kappa-actin. In addition, knockdown of smooth muscle NFAT5 attenuated SMC proliferation in the femoral arteries in experimentally induced arterial hypertension (DOCA/salt model). In a nutshell, this work reveals that NFAT5 – potentially through controlling kappa-actin and TNC expression – plays a hitherto unrecognized important role during hypertension-induced remodelling processes in arteries and possibly arterioles. The underlying mechanism(s) that enable(s) NFAT5 translocation to the nucleus upon stretch may thus serve as (a) potential target(s) for the development of novel treatment options for (cardio)vascular diseases associated with a prolonged rise in arterial blood pressure.