German Title: Mehrfarben-STED Nanoskopie mit hyperspektraler Detektion

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Abstract

Within the scope of this thesis, a new multicolour STED microscope with a hyperspectral detection was designed and built. The challenges regarding the limitation of usable fluorophores as well as the stability of the optical set-up were overcome. Different existing spectral unmixing methods were compared to a self-implemented algorithm, both in simulations and using experimental data. A detailed study of the best separation conditions for several dye combinations was carried out for each of the methods. During the experiments, a spectral blue shift of several dyes was observed and its mechanisms were investigated. The optical resolution of the set-up was dye dependent and better than 80nm for all dyes. Moreover, an excellent separation for three fluorescent bead species and good a separation for a four-colour fixed-cell sample was achieved. This was done for the first time by purely distinguishing the different emission spectra using only one wavelength for excitation and a single STED beam for depletion.

Translation of abstract (German)

In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiges Mehrfarben-STED Mikroskop mit hyperspektraler Detektion konzipiert und aufgebaut. Die Herausforderungen sowohl der Einschränkung an verwendbaren Fluorophoren sowie auch der Stabilität des optischen Aufbaus wurden bewältigt. Verschiedene bereits existierende Methoden zum spektralen Entmischen wurden mit einem selbst programmierten Algorithmus in Simulationen und mit Hilfe experimenteller Daten verglichen. Eine Studie zu den besten Trennungsbedingungen für verschiedene Farbstoffkombinationen für die einzelnen Methoden wurde durchgeführt. Experimentell wurde eine spektrale Blauverschiebung einiger Farbstoffe beobachtet und ihre Mechanismen untersucht. Die optische Auflösung war farbstoffabhängig aber stets besser als 80nm. Ferner wurde eine exzellente Trennung für drei verschieden farbige, fluoreszente Kügelchen und eine gute Trennung in einer vierfach gefärbten, fixierten Zellprobe erzielt. Die Unterscheidung basierte dabei erstmals lediglich auf den Emissionsspektren und wurde mit nur einer Anregungswellenlänge und einem einzigen STED Strahl erreicht.