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Abstract

Ein großer Teil aller therapeutisch wirksamer Arzneistoffe sowie deren Metaboliten werden durch die Nieren aus dem Körper ausgeschieden. Neben der glomerulären Filtration und passiven Transportpro-zessen sind dabei vor allem aktive, durch Arzneistoff-Transporter vermittelte, Transportprozesse in den proximalen Tubuli maßgeblich von Bedeutung. Daher kann die renale Exkretionsrate zahlreicher Arzneistoffe sowohl durch Wirkstoff-Wirkstoff-Interaktionen als auch durch Veränderung der Expres-sionsstärke oder der Aktivität einzelner Arzneistofftransporter beeinflusst werden. Derartige Änderun-gen können aufgrund verschiedener Faktoren wie Nierenerkrankungen, Alter, Schwangerschaft, Ge-schlecht, Ethnizität oder durch Polymorphismen der entsprechenden Transportergene hervorgerufenen werden. Während der Entwicklung neuer Wirkstoffe ist es daher von großer Bedeu-tung, die beteiligten Transportprozesse in den proximalen Tubuluszellen zu identifizieren. Für die Cha-rakterisierung von Arzneistoff-Kandidaten in Hinblick auf die aktive Sekretion wäre ein entsprechendes zellbasiertes In-vitro-Modell daher von großem Nutzen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene zellbasierte Modellsysteme im Hinblick auf ihre Eignung zur Darstellung der aktiven renalen Eliminierung untersucht. Dazu gehörten 1) frisch iso-lierte primäre proximale Tubuluszellen aus der Ratte, 2) für 5 Tage kultivierte proximale Tubuluszellen aus der Ratte, sowie 3) die immortalisierten Nierenzelllinien MDCKII, NRK-52E, IHKE-1 und Caki-1. Zunächst wurde eine Isolationsmethode für primäre proximale Tubuluszellen aus der Ratte etabliert. Die Bestätigung der Isolation wurde durch den Nachweis der proximalen Tubulusmarkerproteine alka-line Phosphatase (AP), Alanin-Aminopeptidase (ALPL), Villin 1 (VIL1) und γ-Glutamyltransferase 1 (GGT1) erbracht. Darüber hinaus konnte die mRNA von 18 in den proximalen Tubuli der Niere expri-mierten Aufnahme- und Efflux-Transportern aus der ABC-, SLC- und SLCO-Familie nachgewiesen wer-den. Auf funktioneller Ebene zeigten die Zellen außerdem eine aktive Aufnahme des organischen An-ions p-Aminohippurat (PAH), sowie des organischen Kations 1-Methyl-4-phenylpyridinium (MPP+). Im nächsten Schritt wurden die isolierten primären proximalen Tubuluszellen kultiviert und anschlie-ßend charakterisiert. Parallel wurde die Charakterisierung auch mit den immortalisierten Nierenzellli-nien durchgeführt und die Daten mit denen der Primärzellen verglichen. Da eine wichtige Vorausset-zung für bidirektionale Transportstudien die Dichtigkeit der Zell-Monolayer ist, wurden die kultivierten Zellen auch im Hinblick auf deren Barriere-Eigenschaften untersucht. Die kultivierten proximalen Tu-buluszellen zeigten eine Epithelzell-typische Morphologie und bildeten dichte Monolayer aus. Durch mRNA-Expressionsanalysen und immunohistochemische Untersuchungen konnte jedoch gezeigt wer-den, dass sich das Expressionsmuster der untersuchten Tight-Junction-Proteine deutlich von dem der frisch isolierten proximalen Tubuluszellen unterschied. Dieses von der In-vivo-Situation abweichende Expressionsmuster wurde ebenfalls in den untersuchten Nierenzelllinien beobachtet. Zudem zeigten die NRK-52E-, IHKE-1- und Caki-1-Zellen eine hohe Permeation von Mannitol, so dass diese für bidirek-tionale Transportstudien nicht geeignet sind. Ein deutlicher Unterschied der Expressionsmuster zwischen den kultivierten proximalen Tubuluszellen und den frisch isolierten Zellen wurde jedoch nicht nur im Fall der Tight-Junction-Proteine, sondern auch bei den proximalen Tubulusmarkerproteinen, sowie bei den untersuchten Transportern beobach-tet. Es wurde daher davon ausgegangen, dass sich die kultivierten Primärzellen in einem Status der Dedifferenzierung befanden. Auch die untersuchten Nierenzelllinien MDCKII, NRK-52E, IHKE-1 und Caki-1 spiegelten nicht die Charakteristika der proximalen Tubuli wider und es wurden von den frisch isolierten Primärzellen abweichende Expressionsmuster der untersuchten Markerproteine und Trans-porter gefunden. Im letzten Teil der Arbeit wurden daher verschiedene Ansätze untersucht, die Transporter-Expression in den kultivierten Primärzellen zu erhöhen. Die Behandlung der Zellen mit Modulatoren des Wnt/β-Catenin- und des Notch-Signalwegs, sowie die Behandlung mit den Steroidhormonen Testosteron und Hydrocortison hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Aufnahme von PAH und MPP+ in die Zellen. Der Einsatz der Wachstumsfaktoren HGF, FGF-1 und EGF führte zu einer leichten Erhöhung der PAH-Aufnahme, während durch den Einsatz von 10 ng/ml EGF eine erhöhte MPP+-Aufnahme beobachtet werden konnte. Eine deutliche Erhöhung der Aufnahme von MPP+ konnte durch Behandlung der kul-tivierten Primärzellen mit 25 mM Kreatinin erreicht werden. Möglicherweise führt die erhöhte Krea-tinin-Konzentration durch einen Rückkopplungsmechanismus zu einer Induktion der Transporter-Ex-pression.