German Title: Dysfunktionell plasmazytoiden dendritischen Zellen aber nicht NK-Zellen im peripheren Blut von Melanompatienten im Stadium IV

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Abstract

Dendritic cells (DCs) and Natural Killer (NK) cells are two key innate immune effectors that are of importance in the initiation and linkage of both innate and adaptive immune responses for preventing growth and spreading of malignant tumours. Immune dysfunction of DCs and NK cells in cancer patients apparently has a critical role in promoting tumour progression and limiting the efficacy of various immunotherapies. Therefore, identification of the mechanisms underlying this impairment and the molecules involved could facilitate the design of effective cancer therapies. In the current work, the integrity of the number and functions of peripheral blood DC subsets, mDC1, mDC2 and pDCs from stage IV melanoma patients were analysed. We found a significant decrease in the absolute numbers of circulating pDCs and mDC2 in melanoma patients compared to aged-matched healthy controls. This change led to alterations of the mDC1/pDC and mDC2/mDC1 balance. Co-incubation experiments revealed an impairment of the mDC/pDC interaction upon CpG A stimulation, with little or no enhancement of surface CD40 expression on mDC1 from melanoma patients. This was in contrast to an up-regulation of CD40 expression on mDC1 from healthy donors under similar condition. The activation of TLR9 signalling in pDCs by CpG A typically induces the production of various pro-inflammatory cytokines and chemokines. Interestingly, purified pDCs and PBMCs from melanoma patients when stimulated with CpG A produced lesser amounts of IFN-alpha than healthy controls. Furthermore, PBMCs from melanoma patients showed lower CCL5, CCL3 and CCL4 fold change compared to healthy controls, suggesting an impairment of TLR9 signalling in pDCs in response to CpG A stimulation. Interestingly, a dysregulated profile of cytokines and chemokines including IL-6, IL-8, CXCL10, CCL2, CCL4, CCL5 and IL-10 was also observed in the sera of patients. Further analysis revealed a significantly stronger up-regulation of MyD88 and both IRF7 mRNA and protein expression in pDCs from healthy controls compared to patients upon TLR9 activation. Using flow cytometry and immunoblot analysis, it was demonstrated that phosphorylation levels of the 4E-BP1 protein, controlling IRF7 mRNA translation, remained constant in CpG A stimulated pDCs and PBMCs from melanoma patients in contrast to healthy donors. Besides, the impairment of IRF7 up-regulation in pDCs from melanoma patients was accompanied by a reduced IRF7 translocation into the nucleus. Taken together, these data indicate that an impairment of the TLR9 downstream signalling cascade is responsible for the reduced IFN-alpha production by pDCs from melanoma patients. Next, enumeration of NK cells in whole blood from melanoma patients revealed a significant reduction in CD56+CD16+ NK cell numbers. Interestingly, we found a significantly higher percentage of NKp30 and NKp46 receptor expressing NK cells accompanied with a higher expression level of both activating receptors on the peripheral blood NK cells from melanoma patients. Furthermore, patient NK cells exhibited comparable functional activity to healthy controls. In conclusion, the data of this study provide evidences for an alteration in the function of circulating pDCs but not of NK cells from melanoma patients. An aberrant IFN-alpha production by pDCs is due to an impaired TLR9 signaling. This provides new insights in designing and improving melanoma therapy.

Translation of abstract (English)

Dendritische Zellen (DCs) und Natürliche Killer (NK) Zellen sind Immuneffektoren, die eine essentielle Rolle in der Initiierung und Verknüpfung von Immunantworten des angeborenen und adaptiven Immunsystems im Rahmen der Abwehr von Tumoren übernehmen. Eine Fehlfunktion von DCs und NK Zellen in Tumorpatienten scheint das Tumorwachstum zu fördern und die Effizienz von Immuntherapien zu beeinträchtigen. Daher ist es wichtig, Mechanismen, die zur Beeinträchtigung der Funktion dieser Effektoren führen, zu identifizieren, um somit eine Entwicklung effizienter Tumortherapien zu ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Integrität der Zahl und Funktion von DC Subgruppen, mDC1, mDC2 und pDCs, aus dem peripheren Blut von Stadium IV Melanompatienten untersucht. Es konnte eine signifikante Reduktion in der absoluten Zahl der zirkulierenden pDCs und mDC2 in Melanompatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen entsprechenden Alters gemessen werden. Diese Reduktion führt zu Veränderungen in der mDC1/pDC und mDC2/mDC1 Balance. Weiterhin konnte im Rahmen einer mDC/pDC Koinkubation mit CpG A gezeigt werden, dass eine Störung der mDC/pDC Interaktion in Melanompatienten vorliegt. So führte die Koinkubation auf den mDC1 von Melanompatienten zu keiner oder nur zu einer sehr schwachen Hochregulation der CD40 Oberflächenexpression, während im Falle der mDC1 gesunder Spender eine deutliche Verstärkung der CD40 Expression detektiert werden konnte. Die Aktivierung der TLR9 Signalkaskade in pDCs durch CpG A induziert typischerweise die Synthese und Freisetzung verschiedener pro-inflammatorischer Zytokine und Chemokine. Interessanterweise zeigten PBMCs und aufgereinigte pDCs von Melanompatienten nach Stimulation mit CpG A eine geringere Produktion von IFN-alpha im Vergleich zu den Zellen gesunder Spender. Außerdem produzierten PBMCs aus Patienten nach CpG A Stimulation geringere Mengen an CCL5, CCL3 und CCL4, was darauf hindeutet, dass die TLR9 Signalgebung in pDCs von Melanompatienten beeinträchtigt ist. Interessanterweise konnte auch ein verändertes Profil von Zytokinen und Chemokinen wie IL-6, IL-8, CXCL10, CCL2, CCL4, CCL5 und IL-10 in Seren von Melanompatienten nachgewiesen werden. Weitere Analysen ergaben, dass die Induktion von MyD88 sowie IRF7 mRNA und Protein infolge TLR9 Stimulation in den pDCs gesunder Spender im Vergleich zu Patienten pDCs signifikant erhöht war. Mittels Durchflusszytometrie und Immunoblot, konnte gezeigt werden, dass der Phosphorylierungsstatus der 4E-BP1 Proteins, welches die IRF7 mRNA Translation kontrolliert, nach CpG A Stimulierung in pDCs and PBMCs von Melanompatienten im Gegensatz zu gesunden Spendern konstant blieb. Neben einer verminderten IRF7 Hochregulation wurde auch eine verringerte Translokation von IRF7 in den Nukleus von pDCs aus Melanompatienten beobachtet. Zusammenfassend deuten diese Daten auf eine Beeinträchtigung des TLR9 nachgeschalteten Signalwegs hin, welche für die verringerte Produktion von IFN-alpha durch pDCs aus Melanompatienten verantwortlich ist. Im Anschluss wurde die Zahl von NK Zellen im Gesamtblut von Melanompatienten bestimmt. Es zeigte sich, dass diese im Vergleich zu gesunden Spendern signifikant reduziert ist. Allerdings konnte in Melanompatienten ein signifikant erhöhter prozentualer Anteil von NKp30 und NKp46 Rezeptor-exprimierenden NK Zellen detektiert werden, einhergehend mit einem erhöhten Expressionslevel beider Rezeptoren. Interessanterweise zeigten NK Zellen aus Patienten und gesunden Spendern eine vergleichbare Aktivität. Die Daten dieser Arbeit beweisen, dass in Melanompatienten die Funktion von zirkulierenden pDCs, aber nicht von NK Zellen, beeinträchtigt ist. Die aberrante IFN-alpha Produktion durch pDCs der Patienten wird durch eine Beeinträchtigung des TLR9 Signalwegs verursacht. Somit konnten neue Erkenntnis für die Verbesserung und Entwicklung gewonnen werden.