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Abstract

Macrophages are a key cellular component of the immune system. In the body they act as front line immune defense and are vital chemical factories that respond to their environment by secreting various chemical mediators. A complete understanding of the molecular details of phagocytotic process and macrophages ability to modulate the signaling activity is still lacking. In the present thesis we designed and used novel nano-materials to understand and modulate macrophage behavior. In order to decipher the cell mechanics and signaling occurring during phagocytotic uptake, we used hollow polyelectrolyte capsules as force sensors. In order to enumerate the forces from the deformations, the capsules were calibrated and a stiffness of 0.11 ± 0.02 nN/nm was found. Using a swept field confocal microscope, we could follow the deformations occurring on the capsule during the phagocytotic uptake. This allowed us for the first time to decipher the mechanics of phagocytosis uptake in its natural state without applying any external mechanical forces or perturbing the cells. It was observed that macrophages during the retraction phase of the uptake, buckled or irreversibly deformed the capsules. From the mechanical characterization, we know that it takes 150 nN to buckle the capsules, this upper limit of the “PhagoSensor” approach is thirty fold higher than the values previously measured by other techniques. To systematically decipher the mechanistic roles of individual molecules in phagocytotic cup formation, we inhibited key signaling molecules PI3-Kinase and SYK, the eccentricity of the deformed capsules was found to be 0.87 ± 0.05 and 0.75 ± 0.05 respectively. This showed that the activation occurs in a sequence. In the second part of the thesis, new implant surfaces were designed for people having a propensity for chronic inflammation. These engineered surfaces can modulate and make macrophages secrete anti-inflammation cytokines. The surfaces comprised of nanopatterned substrates with regular hexagonal spacing of 36, 63, 80 and 125 nm, decorated with Fc fragments. There was a modulation in cell area and cytokine production on the nanopatterns. It was found that the Fc nanopatterns were superior in eliciting anti-inflammation response (TGF-ß & IL-10) than random presentation of Fc fragments. We found that the anti-inflammation effect starts after 24 hrs and at 48 hrs we could see reduced pro-inflammation. Comparing the pro- and anti-inflammatory cytokine production, it was concluded that 36 nm spaced patterns are ideal for eliciting cytokine mediated anti-inflammation signaling. To include both the beneficial effects of polymer surfaces and nanopatterning, a new protein nanopatterning approach for thermochemical nanolithography (TCNL) was developed. This technique can generate high-resolution, multi-protein patterns in arbitrary shapes on polymer substrates. TCNL uses a resistively heated AFM tip to unmask amine groups. We modified the micro and nano patterns generated to include different chemical functionalities and thereby allowing us to bind multiple proteins on the same substrate in different shapes. Several approaches have been developed to immobilize proteins and other biomolecules like DNA onto these templates. These templates are stable and can be stored for later bio-functionalization for at least 4-6 weeks. A strategy to prevent protein adsorption on the surfaces was developed. It was demonstrated that these passivated surfaces reduced the non-specific binding of proteins by approximately 20 times. Finally, the bioactivity of the patterned proteins was demonstrated using an in-vitro protein assay and in-vivo cell assay.

Translation of abstract (German)

Makrophagen sind eine der Schlüsselkomponenten des Immunsystems. Diese Zellen bilden die vorderste Linie der Immunabwehr gegen eindringende Pathogene und dienen als lebenswichtige chemische Fabriken, die auf ihre Umgebung mit der Segregation verschiedener Zytokine und chemischer Mediatoren reagieren. Ein umfassendes Verständnis der molekularen Details des phagozygotischen Prozesses und der Fähigkeit der Makrophagen die Signalaktivität zu modulieren fehlt bis heute. Nanometerstarke, hohle, 4,5 µm große Polyelektrolytkapseln wurden als Kraftsensoren benutzt, um die Mechanik während der Phagozytose zu untersuchen. Um diese Kräfte aus den beobachteten Deformationen zu bestimmen, wurden die Kapseln zuerst kalibriert und mechanisch charakterisiert. Die Steifigkeit der Kapseln war 0,11?0,02 nN/nm. Die Dynamik der Kapseln während der Phagozytose wurde mit Hilfe eines swept-field Konfokalmikroskops verfolgt. Dies erlaubte es uns, erstmalig die Mechanik der phagozytotischen Aufnahme in ihrem natürlichen Zustand ohne das Anwenden externer Kräfte oder anderweitiger Störung der Zellen zu messen. Es konnte beobachtet werden, dass Makrophagen während der Rückzugphase des Aufnahmeprozesses die Kapseln eindellten oder irreversibel zerstören. Aus der mechanischen Charakterisierung ist bekannt, dass ca. 150 nN benötigt werden, um die Kapseln einzudellen. Diese mit dem „Phagosensor“ gemessene Wert ist 30 fach höher als alle zuvor mit anderen Techniken gemessene Werte. Um die mechanistische Rolle individueller Moleküle bei der Bildung des phagozytotischen Cups zu entschlüsseln, wurden die Schlüsselsignalmoleküle PI3-Kinase und SYK inhibiert. Wie erwartet war die Exzentrität der deformierten Kapseln für SYK inaktivierte Zellen 0,87?0,05 und für PI3-Kinase inaktivierte Zellen 0,75?0,05. So konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung sequenziell verläuft. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden neue Implantatoberflächen entwickelt für Patienten mit einer Neigung zu chronischen Entzündungen. Diese Oberflächen können Makrophagen modulieren und dazu bringen, anti-inflammatorische Zytokine zu segregieren. Die Oberfläche dieser Substrate war mit nanostrukturierten Fc-Fragmenten in hexagonalen Abständen von 36, 63, 80 und 125 nm dekoriert. Es konnte eine Modulierung der Zellfläche und der Zytokinproduktion auf den Nanostrukturen gezeigt werden. Desweiteren konnte nachgewiesen werden, dass nanostrukturierte Fc-Fragmente eine stärkere anti-inflammatorische Antwort (TGF-ß & IL-10) auslösen als zufällig verteilte. Die anti-inflammatorische Antwort begann nach 24 h und bis zu 48 h konnte eine reduzierte Entzündungsantwort beobachtet werden. Wenn man die pro- und anti-inflammatorische Zytokinproduktion betrachtet, kann gefolgert werden, dass Nanostrukturen mit 36 nm optimal für das Auslösen einer anti-inflammatorischen Antwort sind. Um die Vorteile von Polymeroberflächen und Nanostrukturierung zu verbinden, wurde eine neue Strukturierungsmethode, die sogenannte thermochemische Nanolithographie (TCNL), entwickelt. Diese Technik kann hochaufgelöste multi-Proteinstrukturen in beliebigen Formen auf Polymeroberflächen generieren. TCNL verwendet eine widerstandserhitzte AFM-Spitze, um Aminofunktionen zu entschützen. TCNL ist 106 Mal schneller als Standard-Dip-Pen-Nanolithographie. Die hergestellten Mikro-und Nanostrukturen wurden so verändert, dass verschiedene chemische Funktionalitäten resultierten. Es wurden verschiedene Verfahren entwickelt, um Proteine oder andere Biomoleküle auf diesen Mustern zu immobilisieren. Die Flexibilität dieses Ansatzes wurde durch die Strukturierung mehrerer verschiedener Proteine auf einer Oberfläche in verschiedenen Formen demonstriert. Die mit TCNL hergestellten Oberflächen sind stabil und können für eine spätere Biofunktionalisierung mindestens 4 bis 6 Wochen aufbewahrt werden. Es wurde weiterhin eine Polyethylenglykol-Passivierung entwickelt, für die gezeigt werden konnte, dass unspezifische Proteinadsorption um einen Faktor von 20 reduziert war. Schließlich konnte die Bioaktivität der Proteinstrukturen in in-vitro Expimenten, wie auch in in-vivo Zellexperimenten gezeigt werden.