German Title: Charakterisierung der Infektivitätsdeterminanten der Hüllproteine des Hepatitis B Viruses

Preview

PDF, English Download (27MB) | Terms of use

Abstract

The human Hepatitis B virus (HBV) is a small hepatotropic DNA virus, which consists of a nucleocapsid and an envelope with three membrane-embedded surface proteins (large (L), middle (M), and small (S)). While the S protein is required for budding and is the major component of the envelope, the L protein is crucial for infectivity. Several infectivity determinants have previously been described: (i) The N-terminal myristic acid moiety together with aa 2-48 are indispensable for virus infectivity and specifically bind a yet unknown receptor. Consistent with this, a peptide HBVpreS/2-48myr, composed of a myristoyl group and the N-terminal 47 residues of the L protein, inhibits HBV entry at picomolar concentrations. (ii) Amino acids 49-78 and the first transmembrane domain of the L protein are also required for virus infectivity. However, their function is not clear. (iii) Recently, it has been shown that the S-domain, which is common to all three surface proteins, also contains an infectivity determinant in its antigenic loop. Currently, it is not fully understood how the virion orchestrates these infectivity determinants during entry process and how exactly the preS-derived peptide HBVpreS/2-48myr interferes with virus entry. The major obstacle, restricting such investigations for a long time, was the lack of easily accessible in vitro infection systems. A recently established human hepatoma cell line (HepaRG), susceptible for HBV infection upon differentiation in vitro, resolved this issue and allowed us to analyze the role of the HBV envelope proteins in virus entry. In the present work, several approaches were undertaken: (i) systematic optimization of HepaRG cells for HBV infection, (ii) establishment of a reverse genetics approach that allows production of virions with mutated envelope proteins, (iii) an extensive mutation analysis within the L and S protein to determine viral assembly and infectivity, (iv) infection-competition study using preS-derived peptides, and (v) design of membrane-anchored inhibitory peptides by replacing the myristoyl group with a type II transmembrane protein. With an optimized infection assay, over 30% of differentiated HepaRG cells could be infected. The optimized infection assay facilitated further infectivity analyses of HBV virions generated by complementation, in which the L and S proteins were separately expressed. The following was observed in the present work: (i) Besides acting as a simple myristoylation signal, the N-terminus of the L-protein (aa 2-8) bears a more complex function for virus entry, since the substitution with heterologous myristoylation motifs abolished virus infectivity. This conclusion is strengthened by a complementary approach showing that the inhibitory potential of the peptide was also severely reduced when amino acids 2-8 were deleted or substituted. (ii) Expression of a membrane-anchored peptide prevents HepaRG cells from HBV infection, probably due to an interference with virus receptor on the plasma membrane. (iii) Amino acids 49-78 of L protein do not tolerate insertions and point mutations at their conserved region, and the peptide comprising aa 49-78 did neither interfere with HBV infection nor inhibit the antiviral activity of HBVpreS/2-48myr. (iv) While the M protein is dispensable for both HBV assembly and infectivity, the preS2 domain as an internal domain of the L protein is needed for virion release in a length-dependent but sequence-independent manner. Notably, HBV with an L protein carrying a mostly scrambled preS2 domain fully supported virion formation and virus infectivity. (v) Cysteine mutations in cytosolic loop-I of L protein drastically reduced virus infectivity, indicating that a properly formed cytosolic loop-I is also required for HBV entry. (vi) The essentiality of the antigenic loops during virus entry is mainly contributed by those in the context of S protein, and is correlated with the binding activity of the virion to heparin. In summary, this data indicates that the myristoyl chain of the L protein provides an anchor into the hepatocyte membrane thereby allowing the subsequent interaction with a hepatocyte-specific receptor. The N-terminal amino acids 2-8 of the HBV L protein serve as an adapter between the myristoyl moiety and the receptor-binding domain that orients the essential receptor binding site into the right position. The preS2 domain is dispensable for the HBV infectivity in vitro. However, it acts as a linker within the L-protein during virus assembly. The S protein may participate in primary attachment of virion to hepatocytes via the antigenic loop, which is critical for virus infectivity. Last but not the least, the membrane-anchored inhibitory peptide presents a promising approach to identify the virus receptor and may be used in a gene therapy approach against HBV infection.

Translation of abstract (German)

Das humane Hepatits B Virus (HBV) ist ein kleines hepatotropisches DNA Virus. Es besteht aus einem Nukleokapsid und einer Hülle mit drei membran-ständigen Oberflächenproteinen (groß (L), mittel (M), und klein (S)). Während das S-Protein Hauptbestandteil der Hülle und für das Budding des Virus notwendig ist, ist das L Protein für die Infektiösität entscheidend. Verschiedene Infektiösitätsdeterminaten wurden beschrieben: (i) Der N-terminale Myristinsäurerest zusammen mit den Aminosäuren 2-48 sind unverzichtbar für die Virusinfektiösität und binden spezifisch an einen bis jetzt unbekannten Rezeptor auf Hepatozyten. In Übereinstimmung mit diesen Erkenntnissen inhibiert ein HBVpreS/2-48myr Peptid, bestehend aus einer Myristolgruppe und den 47 N-terminalen Aminosäuren des L-Proteins , die Eintritt von HBV bereits in picomolaren Konzentrationen. (ii)Die Aminosäuren 49-78 und die erste Transmembrandomäne des L-Proteins sind für die Infektiösität des Virus ebenfalls essentiell. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch nicht geklärt. (iii) Kürzlich wurde gezeigt, dass auch das S-Protein, das in allen drei Oberflächenproteinen vorkommt, eine Infektiösitätsdeterminate im „antigenic loop“ trägt. Bis heute ist noch nicht vollständig verstanden, wie das Virion die verschiedenen Infektiösitätsdeterminaten während des Eintrittsprozesses koordiniert und in welcher Weise das HBVpreS/2-48myr Peptid den Eintritt des Virus behindert. Das Haupthindernis, das solche Untersuchungen für lange Zeit eingeschränkt hat, war das Fehlen eines einfach zugänglichen in vitro Infektionssystems. Eine kürzlich etablierte humane Hepatomazelllinie (HepaRG), die nach Differenzierung in vitro suszeptibel für HBV Infektionen wird, hat dieses Problem gelöst und erlaubt es die Rolle der HBV Hüllproteine während des Viruseintritts zu analysieren. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Ansätze unternommen: (i) Die systematische Optimierung von HepaRG Zellen für HBV Infektion, (ii) Die Etablierung eines Versuchsmodells, das mit Hilfe von reverser Genetik die Produktion von mutierten Hüllproteinen erlaubt, (iii) eine detaillierte Mutationsanalyse der L- und S-Proteine um den viralen Aufbau und die Infektiösität zu bestimmen, (iv) Studien zur Infektionskompetition mit von preS abgeleiteten Peptiden und (v) die Entwicklung von membran-verankerten inhibitorischen Peptiden bei denen die N-terminale Myristoylgruppe durch ein Typ-II-Transmembranprotein ersetzt wurde. Durch die Optimierung des Infektionsassays konnten über 30% der differenzierten HepaRG Zellen infiziert werden. Der optimierte Infektionsassay ermöglichte Infektionsanalysen von HBV Virionen die durch Komplementation generiert wurden. Hierfür wurden das L- und das S-Protein getrennt exprimiert. In der vorliegenden Arbeit wurden folgende Beobachtungen gemacht: (i) Neben der Aufgabe als einfaches Myristoylationssignal zu fungieren, hat der N-Terminus des L-Proteins (Aminosäuren 2-8) auch eine Funktion für den Viruseintritt, da die Substitution mit heterologen Myristoylationsmotiven zu Viren führt, die nicht mehr infektiös sind. Durch einen ergänzenden Ansatz, der zeigt, dass das inhibitorische Potential des HBV preS2-48myr Peptids durch Deletion oder Substitution der Aminosäuren 2-8 stark vermindert wird, konnte diese Beobachtung weiter untermauert werden. (ii) Die Expression eines membranständigen Peptides verhindert die Infektion von HepaRG Zellen mit HBV. Dies geschieht wahrscheinlich durch die Interferenz mit dem Virusrezeptor auf der Plasmamembran. (iii) In der Aminosäurensequenz 49-78 des L-Proteins befindet sich eine konservierte region. Innerhalb dieser Region werden keine Insertionen und Punktmutationen toleriert. Peptide die die Aminosäuren 49-78 enthalten können eine HBV Infektion nicht inhibieren. Diese Peptide beeinflussen die inhibitorische Aktivität von HBVpreS2-48myr Peptiden nicht. (iv) Während das M-Protein für den Viruszusammenbau und für dessen Infektiösität unwesentlich ist, ist die preS2-Domäne, als interne Domäne des L-Proteins, Längen-abhängig aber Sequenz-unabhängig unverzichtbar für die Freisetzung von Virionen. Bemerkenswert ist, dass ein HBV Virus, mit einem L-Protein dass eine beinahe vollständig randomisierte preS2 Domäne aufweist trotzdem keine Defekte bei der Formierung von Virionen oder eine Verminderung der Infektiösität aufweist. (v) Dagegen führen Cysteinmutationen im cytosolischen Loop-I des L-Proteins zu einer drastisch reduzierten Virusinfektiösität. Diese Beobachtung impliziert, dass ein genau geformter cytosolischer Loop-I für die HBV-Eintritt erforderlich ist. (vi) Die Bedeutung der „antigenic loops“ während dem Viruseintritt ist hauptsächlich auf die Loops im S-Protein zurückzuführen und korreliert mit der Bindungsaktivität der Virionen an Heparin. Zusammenfassend implizieren die vorliegenden Daten, dass die Myristoylkette des L-Proteins einen Anker in die Hepatozytenmembran darstellt und somit die folgende Interaktion mit dem Hepatozyten-spezifischen Rezeptor erlaubt. Die preS2-Domäne nicht essentiell für die Infektiösität von HBV in vitro, fungiert aber als ein Linker im L-Protein beim Zusammenbau des Virions. Möglicherweise ist das S-Protein mit seinen für die Infektiösitöt essentiellen „antigenic loops“ an der Initialen Anlagerung eines Virions an die Hepatozyte beteiligt. Das in dieser Arbeit entwickelte membranständige Peptid, bei dem die N-terminale Myristoylgruppe durch eine Typ-II-Transmembranprotein ersetzt wurde eröffnet neue Möglichkeiten bei der Indentifikation des HBV Rezeptormoleküls und eignet sich möglicherweise für die Verwendung in einem gentherapeutischen Ansatz zur Behandlung von chronischen HBV Infektionen.