English Title: Calmodulin-mediated desensitization of the olfactory CNG channel

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Abstract

Das Riechsystem erlaubt Tieren unter einer Vielzahl von Duftstoffen zu unterscheiden, was der Nahrungssuche, aber auch der Identifikation von Partnern oder Feinden, dient. Die Desensitisierung des olfaktorischen CNG - Kanals spielt dabei eine wichtige Rolle. Sie hilft bei der Beendigung der Reizantwort nach Bindung von Duftstoffmolekülen an die Rezeptoren der Riechneurone und dient so der Wiederherstellung des Ruhepotentials. Dies bildet die Voraussetzung für die schnelle Wiedererregbarkeit der Riechneurone, wodurch andauernde Adaptation verhindert wird. Die Bindung von Duftstoffen an G - Protein gekoppelte Rezeptoren in der Cilienmembran der Riechneurone führt zur Bildung von cAMP, das olfaktorische CNG - Kanäle öffnet, was zu einem Ca2+-Einstrom in die Zelle führt. Ca2+ dient unter Anderem der Aktivierung des Ca2+-aktivierten Cl-- Kanals, der die Signalantwort durch den Ausstrom von Cl- verstärkt, wodurch Aktionspotentiale erst möglich sind. Eine Akkumulation von Ca2+ kann durch negative Rückkopplungsmechanismen zur längerfristigen Adaptation des Riechneurons führen. In dieser Arbeit konnte ein molekulares Modell entwickelt werden, das zeigt, wie Calmodulin den Ca2+-Einstrom durch die Desensitisierung des CNG - Kanals vorübergehend begrenzt und so die längerfristige Adaptation verhindert. Frühere Untersuchungen konnten nachweisen, dass die Calmodulin - Bindung an die LQ -Bindestellen der Untereinheiten CNG B1b und CNG A4 für die schnelle Desensitisierung des Kanals verantwortlich ist. Das in dieser Arbeit erarbeitete Modell zeigt durch Protein - Inter-aktionsstudien mit spektroskopischen Methoden, dass Calmodulin bereits beim Ruhepotential des Riechneurons an die CNG B1b Untereinheit des Kanals assoziiert ist. Nach der Aktivierung des Kanals bindet in die Zelle einströmendes Ca2+ an Calmodulin, dessen Konformationsänderung die Interaktion mit der CNG A4 Untereinheit und somit das vorübergehende Schließen des Kanals vermittelt. Es konnte auch die Ca2+- Abhängigkeit dieses Mechanismus erarbeitet werden. Die Proteininteraktionsstudien zeigen auch, wie die Ca2+- Affinität und die Bindeeigenschaften des Calmodulins bei der Wechselwirkung mit verschiedenen Peptiden der CNG B1b und - A4 - Untereinheit beeinflusst werden. Es wurden außerdem die LQ - Calmodulin - Bindemotive näher charakterisiert. Die Aminosäuren Leucin (L) und Glutaminsäure (Q) des LQ - Motivs sind nicht, wie angenommen, für die Calmodulinbindung verantwortlich, sondern beeinflussen die Ca2+- Abhängigkeit der Wechselwirkung. Diese Arbeit erweitert bisherige Erkenntnisse, wie die Aktivierbarkeit von Ionenkanälen durch Calmodulin reguliert wird und zeigt, wie beim Riechen die Desensitisierung des CNG - Kanals die Antwortbereitschaft der Riechneurone erhöht.

Translation of abstract (English)

The olfactory system enables animals to discriminate stimuli from a variety of odor sources, thereby allowing foraging as well as identification of predators and partners for reproduction. In olfactory signal transduction the desensitization of the olfactory CNG channel plays a key role. CNG channel desensitization facilitates response termination upon activation of olfac-tory receptors and helps restoring the resting potential of the olfactory sensory neuron (OSN). The desensitization of the CNG channel therefore sets the conditions required for repeated excitation and prevents long-term adaptation of the OSN. Binding of odour molecules to ciliary G protein-coupled receptors results in an increase of the intracellular [cAMP]. This in turn triggers the opening of CNG channels, leading to the influx of Ca2+. Increased [Ca2+] activates calcium-activated Cl--channels. This results in an outward-directed Cl- current that enhances the depolarization of the neuron thus enabling the generation of action potentials. Prolonged activation of CNG channels may lead to the accumulation of [Ca2+] and long-term adaptation of the OSN. Former studies have shown that calmodulin-binding to the LQ-binding motifs of the subunits CNG B1b and CNG A4 is responsible for the fast desensitization of this channel. This mechanism prevents intraciliary Ca2+- accumulation but an appropriate mechanistic model has not yet been provided. The aim of this thesis was to design a molecular model that accurately describes the interaction of CaM with the LQ-binding sites of CNG B1b and A4. For this purpose CaM interaction studies with peptides of the LQ-binding sites have been performed using spectroscopic techniques. The molecular model created in this thesis shows that CaM is associated with CNG B1b at resting potential. Upon channel activation Ca2+ that enters the cilium bind to CaM, resulting in a conformational change that allows CaM-binding to CNG A4. The channel closes and is for a certain period insensitive to cAMP. To elucidate the Ca2+-dependency of this mechanism, the interactions of CaM/Ca2+ and LQ-peptides were analysed in dose-response experiments. Furthermore it was investigated how the Ca2+ affinity and binding properties of CaM are affected by the interaction. Moreover the role of leucin (L) and glutamic acid (Q) of the LQ-motif has been examined. It has been hypothesized that these aminoacids are responsible for CaM-binding. Interaction studies with CaM and the corresponding LE-mutants could show that the Ca2+-dependency is affected but that CaM-binding is not prevented. Alltogether this work broadens the existing knowledge how calmodulin modulates ion channel activation. Moreover, the model designed explains how the fast desensitization of the olfactory CNG channel enables response termination after odour stimulation of OSNs and thus helps to prevent long-term adaptation of these neurons.