German Title: Funktion des Exozyst Komplexes in der präsynaptischen Nervenendigung der heldschen Calyx

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Abstract

Synaptic vesicles have to be constantly transported to the active zone to ensure ongoing synaptic transmission. Although some proteins which mediate docking and priming of synaptic vesicles have been identified (Munc13, RIM, SNAREs) the molecular mechanisms that mobilize synaptic vesicles from the recycling or reserve pool to the active zone are not well understood. Here, we investigated the involvement of the exocyst complex, a multiprotein tethering complex involved in directed transport of vesicle cargo, in the trafficking of synaptic vesicles. By means of stereotaxic injection of recombinant adeno-associated viral particles into the ventral cochlear nucleus of 2-day-old Sprague Dawley rats we performed acute genetic perturbation of exocyst function by overexpression of a dominant-negative truncation construct of Exo70, a subunit of the exocyst complex, in globular bushy cells to analyze potential changes in synaptic transmission at the calyx of Held. Additionally, the morphology of presynaptic terminals was reconstructed from confocal image stacks to investigate the influence of exocyst perturbation on synaptic architecture and maturation. Manual reconstruction of 166 calyces of Held and subsequent volume analysis revealed that overexpression of the dominant-negative truncation construct of Exo70 results in a statistically significant decrease in nerve terminal volume at P13 indicating induced defects in membrane addition by acute genetic perturbation. Surprisingly, calyces, which overexpressed the truncation construct of Exo70 (Exo70Nter), had comparable volumes to wildtype cells at a matured state in P21 rats. These findings suggest that while exocyst function is necessary during early maturation of calyces of Held it seems to be dispensable at later developmental stages. The developmental stage dependent function of Exo70 is further supported by the observation of a localization shift of the full-length GFP-fusion protein Exo70 between the two ages investigated. While adult calyces in P21 rats display plasma membrane localization for GFP-Exo70, this plasma membrane association is not evident for maturing calyces from P13 animals. Despite the hypomorphic nature of P13 calyces overexpressing Exo70Nter, low frequency (0.1 Hz) stimulation did not affect EPSC kinetics, suggesting that the fusion machinery of synaptic vesicles remained unaffected. Decay of EPSC amplitudes upon repetitive stimulation (0.3 – 100 Hz) was indistinguishable from wildtype, suggesting that exocyst is not involved in the molecular mechanisms underlying short-term depression. Similarly, readily releasable pool size and kinetics of recovery from depression, frequency of spontaneous release, quantal size and mEPSC kinetics remained unaffected by Exo70Nter overexpression. Thus, perturbation of exocyst function by overexpression of a dominant-negative truncation construct of Exo70 did not affect synaptic transmission, suggesting that exocyst does not contribute to the synaptic vesicle cycle and neurotransmitter release. In summary, our findings show that the exocyst complex is required for presynaptic membrane addition at early stages of calyx maturation, while a role as a tethering factor of synaptic vesicles in local vesicle recycling remains unlikely. Thus, the exocyst complex may be required for the delivery of cargo from the cell soma to synaptic terminals, but not for trafficking steps in the synaptic vesicle cycle.

Translation of abstract (German)

Synaptische Vesikel müssen fortlaufend zur aktiven Zone transportiert werden, um eine anhaltende synaptische Transmission sicherzustellen. Obwohl einige Proteine, die das Andocken und priming von synaptischen Vesikeln vermitteln, bereits identifiziert wurden (Munc13, RIM, SNAREs), sind die molekularen Mechanismen, die synaptische Vesikel vom Recycling- oder Reservepool zur aktiven Zone befördern, nicht vollständig verstanden. In dieser Studie haben wir die Beteiligung des Exozystkomplexes, einem Multiproteinkomplex der zum gerichteten Transport vesikulärer Fracht beiträgt, am Zyklus synaptischer Vesikel in vivo untersucht. Durch die stereotaktische Injektion von rekombinanten adeno-assoziierten viralen Partikeln in den ventralen kochleären Kern von 2 Tage alten Ratten konnten wir ein dominant negatives Konstrukt von Exo70, einer Untereinheit des Exozystkomplexes, in globular bushy cells überexprimieren. Dadurch wurde eine akute genetische Störung der Exozystfunktion hervorgerufen, anhand welcher mögliche Veränderungen der synaptischen Transmission in der Heldschen Calyx untersucht werden konnten. Zusätzlich wurde die Morphologie der präsynaptischen Endigung anhand konfokaler Bildsequenzen rekonstruiert, um den Einfluss des Exozystkomplexes in Hinblick auf Architektur und Reifung der Synapse zu untersuchen. Manuelle Rekonstruktion von 166 Heldschen Calyces und darauf folgende Volumenbestimmung ergab, dass die Überexpression des dominant negativen Konstruktes von Exo70 in einer statistisch relevanten Verminderung des Volumens von reifenden (P13) Nervenendigung resultiert. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die akute genetische Perturbation Defekte im Membranaufbau hervorruft. Überraschenderweise zeigten Calyces von P21 Ratten im maturierten Stadium, welche das verkürzte Konstrukt von Exo70 (Exo70Nter) überexprimieren, ein mit Wildtypzellen vergleichbares Volumen. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Exozystfunktion für die frühe Reifung der Heldschen Calyx notwendig, in späteren Entwicklungsstadien allerdings verzichtbar ist. Die funktionelle Abhängigkeit von Exo70 zum Entwicklungsstadium wird weitergehend durch die Beobachtung gestützt, dass die Lokalisation des Wildtyp-Exo70 Proteins zwischen den beiden Entwicklungsstadien (P13 und P21) einer Veränderung unterliegt. Während GFP-Exo70 in adulten Calyces (P21) an der Membran auftritt, ist dieses Lokalisationsmuster in heranreifenden Calyces (P13) nicht zu beobachten. Ungeachtet des hypomorphen Phänotyps der P13 Calyces, welche Exo70Nter überexprimieren, blieb die EPSC Kinetik bei der Stimulation mit niedrigen Frequenzen (0,1 Hz) zum Wildtyp vergleichbar. Dies deutet darauf hin, dass die Fusionsmaschinerie für synaptische Vesikel durch den experimentellen Ansatz unbeeinflusst bleibt. Die Abnahme der EPSC Amplitude durch repetitive Stimulation (0,3 – 100 Hz) war identisch zum Wildtyp, was darauf hindeutet, dass der Exozyst bei den molekularen Mechanismen, die der short-term depression zugrunde liegen, keine Rolle spielt. Ebenso blieb durch die Überexpression von Exo70Nter die Größe des readily releasable pools, die Kinetik der Erholung nach Depression, die Frequenz der spontanen Freisetzung, die Quantengröße und mEPSC Kinetik unverändert. Die Perturbation der Exozystfunktion durch die Überexpression eines dominant negativen verkürzten Konstruktes von Exo70 führte folglich nicht zur Veränderung der synpatischen Transmission. Dies deutet darauf hin, dass Exozyst weder an dem synaptischen Vesikelzyklus noch an der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt ist. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass der Exozystkomplex für den präsynaptischen Membranaufbau im frühen Stadium der Calyxreifung notwendig ist. Die Funktion des Exozyst als tethering-Faktor von synaptischen Vesikeln im lokalen Vesikelrecycling erscheint dagegen unwahrscheinlich. Folglich könnte der Exozystkomplex beim Transport vesikulärer Fracht vom Zellsoma zu den synaptischen Endigungen notwendig sein, nicht aber in Transportprozessen des synaptischen Vesikelzyklus.