English Title: Bispecific Antibodies for Cancer Therapy

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Abstract

Bispezifische Antikörper (bsAk) eröffnen für die Immuntherapie von Krebserkrankungen neue Möglichkeiten und wurden bereits mit einer Vielzahl unterschiedlicher Kombinationen an Tumorantigenen und Effektorfunktionen ausgestattet. Die Relevanz dieser Wirkstoffklasse wurde erst kürzlich durch die Zulassung des bispezifischen Präparates Catumaxomab (Removab®) unter Beweis gestellt. Die breite Anwendung konventioneller bispezifischer Antikörper ist jedoch aus technischen Gründen begrenzt. Zu den meist zitierten Engpässen zählen aufwändige Reinigungsprozesse, geringe Ausbeuten und damit einhergehende hohe Produktionskosten, die meist murine Herkunft und das große Molekulargewicht, dass die Penetration in solide Tumoren erschwert. Um die angeführten Problemstellungen anzugehen, haben wir die Herstellung der bsAk in B-Zell Hybridomen vorgenommen, um möglichst auf einen professionellen Antikörperproduzenten zurückzugreifen. Der Grundgedanke hierbei war, den bispezifischen Antikörpern eine Struktur und ein genetisches Umfeld zu sichern, das konventionellen Antikörpern möglichst nahe kommt. Durch genetische Manipulation wurden bsAk synthetisiert, die aus einem Fab-Fragment bestehen, an den ein disulfidbrückenstabilisierter single-chain Antikörper (dsFv) fusioniert wurde und die somit ein deutlich kleineres Molekulargewicht aufweisen (80kDa bsAk gegenüber 150kDa IgG). Durch die Einführung humaner konstanter Domänen wurden Anstrengungen unternommen, die Immunogenität zu minimieren. Am Beispiel der bsAk FabHEAxdsFvOKT3.V3 und FabL1xdsFvOKT3.V3 werden in dieser Arbeit verschiedene Wege aufgezeigt, um den aktiven Antikörperlokus der anti-EpCAM bzw. anti-L1CAM produzierenden Hybridomlinien HEA125 und HuL1-9.3 neu zu gestalten. Grundlage hierfür war eine Kombination aus homologer Rekombination (HR) und ortsspezifischer Integration (SSR). Die eingefügte Transfektionskassette kodierte für einen disulfidbrückenstabilisierten anti-CD3 scFv-Antikörper (dsFvOKT3), der an die humane CH1-Domäne der schweren IgG1-Kette fusioniert wurde. Die Kassette wurde von Homologieregionen flankiert, die sich spezifisch an den endogenen Antikörperlokus der Maus anlagern und sich dabei am 5’ Ende mit der CH1 Domäne und am 3’ Ende mit der CH3 Domäne überlagern. Nach erfolgter Rekombination, wurde die Gesamtheit der murinen konstanten Domänen (CH1-CH3) durch die CH1-dsFvOKT3 Fusion ersetzt. Hieraus ergaben sich Hybridomlinien, die anstelle des konventionellen Parentalantikörpers, kleine bispezifische Antikörper sezernieren. Es konnte über Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, dass FabHEAxdsFvOKT3.V3 und FabL1xdsFvOKT3.V3 an ihre zellulären Zielantigene EpCAM und CD3 bzw. L1CAM und CD3 binden. Beide bsAk erweisen sich in der proteinbiochemischen Analyse zudem als korrekt assembliert und rein. In weiterführenden Experimenten wird nun getestet, ob die bsAk die Fähigkeit besitzen, die T-Zell-vermittelte Tumorzelllyse in vitro einzuleiten. Dabei erfolgt die Tumor-Erkennung über das Fab-Fragment, welches sich von den Parentalantikörpern ableitet, während der dsFvOKT3-Anteil CD3+ T-Zellen aktiviert und an die Tumorzellen bindet. Sollten diese Erwartungen erfüllt werden, können beide Antikörper als Kandidaten für weiterführende präklinsche Studien verwendet werden und möglicherweise in die Entwicklung zweier neuer Krebsmedikamente einmünden. Eine weitere Anwendung findet die hier entwickelte Methode in der HybLib´ Bibliothek, die gegenwärtig in unserer Abteilung hergestellt wird. Hierbei handelt es sich um eine Hybridombibliothek komplett humaner Antikörper, welche die natürliche Antikörpermaschinerie von B-Zellen, die Signalgebung durch Oberflächenpräsentierte Antikörper (B-Zell Rezeptor) und die Affinitätsreifung durch die zelleigene somatische Hypermutation nutzt. Das Verfahren, das in dieser Dissertation zur Expression bispezifischer Antikörper in Hybridomen beschrieben wird, ist dazu konzipiert worden, diese Bibliothek zu ergänzen und ermöglicht es fortan den Wirkungsmechanismus des Antikörpers sehr leicht an die therapeutischen Anforderungen anzupassen. Die Methodik versteht sich als genomischer Schalter zwischen konventionellem und bispezifischem Format und wurde in der vorliegenden Arbeit erfolgreich in die Praxis umgesetzt. Das bispezifische Gerüst kann nun ohne großen Aufwand auf neue Spezifitäten angepasst werden.

Translation of abstract (English)

Bispecific antibodies are excellent activators of the immune system and have been generated against different combinations of tumor antigens and trigger molecules on effector cells. Their relevance was shown recently with market approval of the bispecific compound Catumaxomab (Removab®). However, clinical use of bispecific antibodies is hampered for technical reasons, namely lengthy purification, expensive production engendered by the low yield, mouse origin of conventional antibodies, and their large molecular weight that hinders diffusion into solid tumors. To address those problems we used B cell hybridomas trained by the immune system as host cells for the production of high amounts of antibodies. Secondly, genetic engineering was performed to reduce immunogenicity (human constant domains) and to generate small fusion proteins with improved tissue penetration (80kDa for bsAb compared to 150kDa for IgG). The aim was a prototypic format, in which a Fab-fragment was fused to a disulfide-stabilized single-chain antibody (dsFv) as secondary specificity. In this study several methods are described to redesign the active antibody gene locus of the anti-EpCAM or anti-L1CAM producing hybridoma lines HEA125 and HuL1-9.3 using a combination of homologous recombination (HR) and site-specific integration (SSR). A gene cassette encoding an anti-CD3 antibody (dsFvOKT3) fused to the human CH1 domain of the IgG1 heavy chain was cloned. The cassette was flanked by regions homologous to the endogenous antibody locus of the heavy chain, where the sequences overlap with the 5’ end of the CH1 domain and with the 3’ end of the CH3 domain. After homologous recombination, murine constant domains (CH1 to CH3) were entirely replaced by the CH1-dsFvOKT3 fusion. This resulted in hybridoma cell lines secreting small bispecific antibodies rather than the original full-size monoclonal antibodies. The antibodies FabHEAxdsFvOKT3.V3 and FabL1xdsFvOKT3.V3 were shown by flow cytometry to bind both EpCAM and CD3 or L1CAM and CD3 antigens, respectively, on target cells. Furthermore, both antibodies were shown to be fully assembled and pure in subsequent protein analysis. In future experiments the compounds will be tested in vitro for their potency to prime T-cells for lysis of EpCAM- or L1CAM-expressing tumor cells. Thereby the Fab-fragment derived from the parental antibodies HEA125 and HuL1-9.3 assumes tumor-targeting, while the dsFvOKT3-fragment should enable targeting and activation of CD3+ cytotoxic T-cells. If the antibodies meet these expectations, they could be considered as candidates for further evaluation towards preclinical studies and possibly open out into the development of new drugs against cancer. In our department we are currently developing the HybLib Library of fully human antibodies by exploiting the efficient antibody expression apparatus of B-cell hybridomas. Aside facilitated screening of the library using mammalian display and BCR signalling, the system also benefits from the somatic hypermutation machinery for affinity maturation. The method for the production of small bispecific antibodies described above was intended to complement the library with a tool to individually adapt the mechanism of cytotoxicity of the drug to the therapeutic requirements. The genomic switch from the conventional to the bispecific format could be put into practice successfully. The bispecific antibody framework can now easily be adapted to other specificities.