German Title: Entwicklung und Design eines räumlich und zeitlich aufgelösten Fluktuationsmikroskops für die Analyse von molekularen Bewegungen und Wechselwirkungen

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Abstract

A spatial and temporal fluctuation microscope (STFM) was developed for fast imaging as well as the measurement and visualisation of mobilites and interactions of fluorescently labeled particles. The instrument extends the concept of a point confocal laser-scanning microscope to illumination and detection along a line. For the construction and application of the STFM, theoretical descriptions of the beam geometry, the point spread functions and the fluorescence auto- and cross-correlation fit functions were derived. The final system provids fast confocal imaging up to 30 images per second and allows for the spatially resolved detection of particle concentration fluctuations down to 15 μs time resolution at hundreds of points in parallel. An optical resolution of 200 x 380 x 700 nm in x-, y- and z-direction was determined experimentally, and the spatially resolved fluctuations of fluorescent quantum dots were evaluated. Finally, the capabilities of the STFM in terms of fast imaging and mobility measurements were applied to studies of PML nuclear bodies and green fluorescent protein in living cells. Both the in vitro and the in vivo fluorescence correlation spectroscopy experiments conducted with the STFM were compared to single point measurements with a commercial point-confocal microscope and FCS setup. The results demonstrate the unique capabilities of the STFM for the characterisation of position-dependent diffusive translocations of macromolecules in the cell with very high time resolution.

Translation of abstract (German)

Ein räumlich und zeitlich aufgelöstes Fluktuationsmikroskop (STFM) wurde für die schnelle Bildaufnahme und die Messung und Visualisierung der Beweglichkeiten und Wechselwirkungen von fluoreszenzmarkierten Partikeln entwickelt. Das Instrument erweitert das Konzept eines punktkonfokalen Laser-scannenden Mikroskops zur Beleuchtung und Detektion entlang einer Linie. Für die Konstruktion und die Anwendung des STFM wurden eine theoretische Beschreibung der Strahlgeometrie, der Punkt-Aufweitungsfunktionen und der Auto- und Kreuz- Korrelationsfunktionen abgeleitet. Das entwickelte Gerät ermöglicht eine schnelle konfokale Bildaufnahme und erlaubt die räumlich aufgelöste Detektion der Konzentrationsfluktuationen von Partikeln bis zu einer Zeitauflösung von 15 μs, parallel gemessen an einigen hundert Punkten. Ein optisches Auflösungsvermögen von 200 x 380 x 700 nm in x-, y- und z-Richtung wurde experimentell bestimmt und die räumlich aufgelösten Fluktuationen von fluoreszenten Nanopartikeln wurden ausgewertet. Schließlich wurden die Möglichkeiten des STFM in Bezug auf die schnelle Bildaufnahme und Beweglichkeitsmessung angewandt, um PML-Kernkörper und grün-fluoreszierendes Protein (GFP) in lebenden Zellen zu untersuchen. Sowohl in vitro als auch in vivo mit dem STFM durchgeführte Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie-Experimente wurden mit Einzelpunkt-Messungen an einem kommerziellen Punkt-Konfokal-Mikroskop und -FCS-System verglichen. Die Ergebnisse zeigen die einzigartigen Möglichkeiten des STFM, die von der Position abhängige diffusive Translokation von Makromolekülen in lebenden Zellen mit sehr hoher Zeitauflösung zu charakterisieren.